独特P450单加氧酶家族多策略协同驱动环肽怡莱霉素的六电子氧化修饰

体外酶学研究表明，独特细胞色素P450单加氧酶IlaL能够催化ilamycin B₁和B₂末端甲基的连续氧化，并分别生成更高氧化态的ilamycin F和D。质谱分析进一步捕获了反应过程中的醇和醛中间体，明确了IlaL所催化的连续反应过程：“甲基→醇→醛→羧酸”。 这一过程包含连续三轮氧化反应，总计实现六电子转移。相关实验进一步明确了IlaL的底物特异性、催化活性及反应动力学特征，从生化层面揭示了IlaL作为怡莱霉素成熟过程中关键六电子氧化酶的功能。

为进一步解析IlaL催化复杂环肽连续氧化的结构基础，研究团队解析了IlaL与天然底物ilamycin B₂复合物的高分辨率晶体结构。结构分析显示，IlaL具有显著扩大的底物结合腔，并形成了延伸且具有较高柔性的BC-loop。二者共同构建了适应复杂环肽底物的动态识别界面，使ilamycin B₂能够以特定构象进入活性中心，并将待氧化的末端甲基精准定位于催化中心附近。这一独特的结构特征为IlaL能够识别体积较大的环肽底物，并在同一活性中心内连续完成多步氧化提供了结构基础。

IlaL更为独特之处在于其采用了不同于经典P450（DT/DS, ET/ES）的非经典Asp-Asn（DN）分子氧活化单元。结构分析与定点突变实验表明，Asp241-Asn242二联体与活性中心水分子共同参与催化过程中的质子转移和分子氧活化。其中，Asn242突变后IlaL催化活性完全丧失，表明该残基在催化过程中发挥关键作用。基于结构、生化和突变实验结果，研究团队提出了IlaL介导连续氧化的催化机制：DN二联体通过协同调控质子转移与分子氧活化，使IlaL能够在同一活性中心内连续完成三轮氧化反应，最终实现末端甲基向羧基的六电子转化。该机制揭示了细胞色素P450单加氧酶实现多轮连续氧化的一种新模式。

进一步的系统发育分析显示，IlaL属于一个独特的DN型P450分支。在所分析的P450序列中，具有这一DN型催化特征的成员仅占约1%。该分支成员部分具有与DN催化单元相伴的特殊BC-loop序列特征，部分同源蛋白还分布于与环肽天然产物生物合成相关的基因簇中。值得注意的是，IlaL是目前该DN型P450分支中唯一经过生化验证的六电子氧化酶。这一发现将IlaL的独特催化机制与其系统发育特征联系起来，为从微生物基因组和天然产物生物合成基因簇中定向识别潜在多电子氧化酶提供了新的筛选依据。

本研究揭示了新型细胞色素P450单加氧酶的多策略协同驱动环肽连续氧化的机制，建立了IlaL介导六电子氧化的结构与机制框架。从早期解析ilamycin生物合成途径，到开展衍生物生物合成与抗结核作用机制研究，再到此次深入解析关键P450酶的结构与催化机制，团队持续推进对ilamycin这一重要天然产物的系统研究。本项工作进一步将研究从“怡莱霉素如何合成”拓展至“关键结构单元如何精准催化”，为新型细胞色素P450单加氧酶的挖掘及天然产物生物合成与酶工程改造提供了新的理论依据和酶学工具。

该研究得到了国家自然科学基金区域创新发展联合基金重点项目、国家自然科学基金重点项目，国家重点研发计划等多个项目的支持。

Ming Peng, Qiaoling Wu, Yingying Chen, Yuyang Wang, Jianqiao He, Lele Ma, Xianhao Wang, Mengyu Li, Wei Jiang, Hongjie Zhu, Weilong Liu, Zhuo Shang, Zhao-jieTeng,* Jianhua Ju,* and Junying Ma*, An Enzyme from a Single P450 Monooxygenase Clade Orchestrates Six‑Electron Oxidation for Cyclopeptide Modification. ACS Catal. 2026.