中国药科大学肖易倍、陆美玲Molecular Cell！！解析CRISPR-Cas9记忆形成的关键结构机制

CRISPR-Cas系统是原核生物中一种重要的适应性免疫机制，通过将外源DNA片段（称为前间隔序列）整合到宿主基因组中的CRISPR阵列，赋予细胞对特定病原体的记忆能力。在这一系统中，II-A型CRISPR-Cas9因其在基因组编辑中的广泛应用而备受关注，但其间隔序列获取的具体机制，尤其是Cas9蛋白如何参与这一过程，仍存在许多未解之谜。间隔序列获取是CRISPR免疫的第一步，涉及Cas1-Cas2整合酶复合物将外源DNA片段插入CRISPR阵列，但II-A型系统缺乏Cas4蛋白，而Cas1本身无法识别原间隔序列邻近基序（PAM），这导致PAM识别和间隔序列选择如何耦合的问题长期悬而未决。中国药科大学肖易倍教授团队与合作者的最新研究针对这一空白，通过结构生物学方法揭示了Cas9在II-A型系统中导向间隔序列获取的分子基础。这项研究不仅填补了CRISPR-Cas系统基础理论的关键漏洞，还为理解适应性免疫的进化提供了新视角，对开发更精准的基因编辑工具具有潜在意义。该成果以封面形式发表于《Molecular Cell》期刊，凸显了其重要性。

研究团队利用冷冻电镜技术解析了粪肠球菌来源的Cas9-Csn2-Cas1-Cas2超复合物在两种状态下的高分辨率结构：一是非结合状态的静息复合体（Cas9₂-Csn2₈-Cas1₈-Cas2₄），二是DNA结合状态的前间隔序列捕获复合体。结构分析表明，在DNA结合后，复合物发生构象变化，使DNA穿过Csn2蛋白的中央通道，从而允许Cas9沿DNA滑动并探查PAM序列。Cas9与Csn2共同界定了一段30碱基对的DNA区域，其长度与典型的前间隔序列匹配，确保了间隔序列选择的特异性。进一步实验显示，Cas9的解离会触发Csn2-Cas1-Cas2组装体的结构重排，暴露出PAM邻近的DNA区域，使得Cas1-Cas2整合酶能够结合该位点，启动后续的定向整合过程。这些发现首次在原子水平展示了Cas9如何与Csn2、Cas1-Cas2协同工作，将PAM识别与前间隔序列处理相耦合，从而保证间隔序列获取的保真性和效率，避免了自我靶向的风险。

该研究的发现具有重要的理论价值和应用潜力。从机制层面看，它阐明了II-A型CRISPR-Cas系统中Cas9的直接参与作用，解决了长期以来关于PAM识别如何引导间隔序列获取的争议，为CRISPR免疫的进化研究提供了结构基础。此外，这项成果可能推动基因组编辑技术的优化，例如通过模拟自然界的间隔序列获取机制，设计更高效、更特异的基因编辑工具。研究团队包括中国药科大学和新加坡国立大学的多位学者， work 得到了国家重点研发计划等项目支持，体现了国际合作的协同效应。未来，基于这一结构模型，可以进一步探索CRISPR-Cas系统在其他生物中的变体，或开发针对特定疾病的 therapeutic 应用。总体而言，这项研究不仅深化了对原核生物免疫机制的理解，也为生物技术领域带来了新的灵感。

信息来源：医学研究前沿

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