引子：

本文是Tony Cundell博士在American Pharmaceutical Review杂志文章“Is Bacillus subtilis Objectionable in a Non-Sterile Oral Liquid Solution?”的全文翻译。听过不少不可接受微生物评估的讲座，也写过一些个人意见的文章，但是一直觉得缺少实战的演练。这篇文章正好就是给你打了个样，你完全可以遵循作者的思路和框架，更换你自己的产品信息和配套资料，完成不可接受微生物的评估。文章很长，但是值得收藏分享给更多需要的人。

简介

美国联邦药品生产质量管理规范（GMP）法规，即《联邦法规汇编》第21篇第211.113节（微生物污染控制），要求药品生产商在其非无菌药品中排除不可接受的微生物。哪些微生物可能被视为不可接受，可以从临床文献、与药品和医疗器械相关的微生物感染爆发调查以及（程度较轻的）美国药品召回信息中确定。在缺乏监管指南的情况下，这一问题曾是2014年PDA技术报告第67号《在非无菌药品、非处方药品、医疗器械和化妆品中排除不可接受微生物》的主题。该PDA技术报告得出结论认为，哪些属于不可接受微生物将取决于药品剂型、配方、单个药品的物理化学及微生物属性及其预期用途。作者在最近的一篇书籍章节中更新了这些内容（Cundell, 2020）。

根据Sutton和Jimenez（2012年）发布的美国非无菌产品召回调查，每年约有15-20起召回。也许令一些人惊讶的是，召回的主要原因是这些产品中存在不可接受的微生物（占72%），而不是超过了推荐的微生物限度。

在2004-2011年的7年期间，共有144种非无菌药品被自愿召回。按产品类型划分，召回情况为：非处方药品（42%）、化妆品和肥皂（31%）、医疗器械（14%）、膳食补充剂和益生菌（8%）以及药品（5%）。由于处方药严格遵守现行药品生产质量管理规范（cGMPs）且拥有更多的财力与技术资源，其召回数量在这些产品类型中最少可能并不出人意料。在这144起召回中，涉及的不同微生物及其频率为：洋葱伯克霍尔德菌（34起召回，占所有召回的24%）、未具体说明的真菌（19起召回，占13%）、蜡样芽孢杆菌（9起召回，占6%）、铜绿假单胞菌（6起召回，占4%）、脑膜脓毒性伊丽莎白菌（5起召回，占4%）、恶臭假单胞菌（3起召回，占2%）、假单胞菌属（2起召回，占2%）和沙门氏菌属（1起召回，占1%）。

蜡样芽孢杆菌在轻微、自限性肠道功能紊乱中的作用可能是该细菌被召回的一个原因。根据FDA的《有害微生物手册》，食品中大量存在蜡样芽孢杆菌（大于10^6cfu/克）表明该生物体活跃生长和增殖，这与由于产生细菌肠毒素而存在潜在健康危害是一致的。这些数量远远超过了口服液建议的“需氧菌总数不超过100 cfu/克”的限度。

作者之所以关注此问题，是因为2019年12月18日，制造商Lannett公司（位于宾夕法尼亚州费城）因微生物污染在全国范围内自愿召回了抗癫痫药左乙拉西坦口服溶液（100 mg/mL）。FDA网站（www.fda.gov/recalls）上发布的召回通知称，该产品受到污染是因为在用于生产该产品的一种药用原料中发现了革兰氏阳性芽孢杆菌——枯草芽孢杆菌。

本文将探讨，如果在这种口服溶液中发现这种常见环境细菌的数量少于100 cfu/mL，是否应被视为不可接受微生物。作者认为，制造商采取的立场值得商榷，并且在进行了全面的微生物污染风险评估后，不太可能采取这种立场。

与产品召回相关的风险声明称：“枯草芽孢杆菌在环境中普遍存在，尽管其致病潜力被描述为较低，但已有严重全身性感染的报道。健康危害的可能性取决于微生物污染的程度、剂量和治疗持续时间以及患者的基础状况。免疫功能低下的患者有可能发生严重感染。迄今为止，Lannett公司尚未收到任何与此次召回相关的不良事件报告。”

作者认为，产品的配方、给药途径和剂量（即每日两次使用滴管或量杯口服给药）与全身性感染无关，且目标患者群体（即癫痫患者）不太可能是免疫功能低下者，这些都降低了风险。

产品配方

根据药品说明书，左乙拉西坦口服溶液（100 mg/mL）是一种清澈、无色、葡萄味的液体，装在473毫升（16液量盎司）的HDPE瓶中。每毫升含有100毫克左乙拉西坦。非活性成分包括：乙酰磺胺酸钾、柠檬酸、香精、甘油、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、纯化水、柠檬酸钠和山梨糖醇溶液。各成分的功能和微生物学属性总结于表1。

表1：药用成分、其功能和微生物学属性

MIC = 最低抑菌浓度

影响枯草芽孢杆菌芽孢在产品中利用成分萌发和生长的关键物理化学和微生物学参数包括口服液的pH值、水分活度以及防腐体系对枯草芽孢杆菌的效力。尽管该细菌可以代谢山梨糖醇，但低pH值（4-5）和降低的水分活度（0.7-0.8）将阻止细菌生长，而对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯的防腐体系将对芽孢萌发后形成的任何营养体枯草芽孢杆菌具有活性（《药用辅料手册》）。

根据2001年NSF/ANSI关于非潜在危害食品的标准，pH值小于或等于4.6且水分活度小于或等于0.85的食品不属于潜在危害食品。请注意，相关细菌蜡样芽孢杆菌生长的最低pH和aw要求分别为4.9和0.93。

更为相关的是，同一文件指出，对于含有芽孢但不含营养细胞的、无需进行时间/温度控制的所谓“安全”食品，其最大aw值为0.92。国际知名的细菌芽孢专家Peter Setlow实验室最近发表的一篇文章（Rao等，2017年）表明，将aw降至≤0.90的保湿剂可通过抑制芽孢皮层肽聚糖水解和/或吡啶二羧酸释放的活化，阻止枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌芽孢的萌发。水分活度将通过两种机制发挥微生物控制作用，即防止芽孢萌发和抑制萌发后芽孢的生长。

此外，枯草芽孢杆菌在pH低于4.9的口服溶液中不会生长，如果pH较高且发生生长，其营养细胞将被对羟基苯甲酸酯类防腐体系杀灭。基于栅栏技术的概念，该产品将不支持微生物生长，且营养体微生物无法在产品中存活（Leistner, 1994）。

摄入的枯草芽孢杆菌芽孢会发生什么变化？芽孢杆菌属是肠道微生物群中的一个次要组成部分，其数量略高于从摄入植物材料中预期的水平。芽孢能在胃的酸性胃液和上肠道的胆汁盐中存活，可能在肠道内萌发，并以营养细胞或芽孢形式随粪便排出。枯草芽孢杆菌作为一种严格需氧菌，预计在下肠道的缺氧条件下生长不良（Hong等，2005年）。

尽管FDA的警告信没有透露含有枯草芽孢杆菌的药用成分的身份，但作者推测其为山梨糖醇溶液（70%，USP）。目前的USP专论没有微生物学要求，但其配套的山梨糖醇粉末专论则有。

后者的规定是，使用平板法的需氧菌总数不超过1000 cfu/克，霉菌和酵母菌总数不超过100 cfu/克。作者在早前的一篇出版物中已讨论过药用辅料的微生物学属性（Cundell, 2005年）。

根据《药用辅料手册》，山梨糖醇最有可能通过镍催化剂高压氢化高果糖玉米糖浆来制造。70%山梨糖醇的水分活度约为0.8，因此不支持芽孢萌发和细菌生长，但在合成后进入产品的细菌内生芽孢可能在此物料中持续存在，并被带入口服溶液。

考虑到70%山梨糖醇在工业上的广泛使用，仅因其含有枯草芽孢杆菌这种普遍存在的环境细菌的芽孢而禁止制药行业使用该原料是不合理的。

芽孢杆菌属的哪些成员在非无菌药品中属于不可接受微生物？

显然，更具侵袭性的主要细菌病原体——炭疽芽孢杆菌在任何非无菌药品中都属于不可接受微生物，但在GMP条件下生产的药品中含有该细菌的可能性极低。尽管是肠毒素而非细菌本身引起肠道功能紊乱，但根据非无菌药品的剂型、配方和预期用途，有理由将蜡样芽孢杆菌指定为不可接受微生物。表2提供了六种常见芽孢杆菌的一些特征。

表2：区分六种常见芽孢杆菌的特征（根据《ASM临床微生物学手册》第10版）

E=椭圆形，S=球形，C=圆柱形，T=终端，V=可变

发酵食品和膳食补充剂中的枯草芽孢杆菌

从对发酵食品和益生菌的回顾中，摄入枯草芽孢杆菌芽孢的安全性变得更加明显。能合成多聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌菌株被用作纳豆（一种在日本饮食中很受欢迎的发酵大豆食品）生产的发酵剂（Kubo等，2011年）。据报道，纳豆中的芽孢计数超过10^8 cfu/克。在东欧、亚洲和南美洲，市场上销售着含有数十亿枯草芽孢杆菌芽孢的益生菌产品（Hong等，2005年）。综合评估已证明这些益生菌产品在毒性和致病力方面的安全性（Sanders等，2003年；Hong等，2008年；Jezewska-Frackowiak等，2018年）。

尽管FDA尚未批准益生菌菌株作为公认安全（GRAS）物质的一项政策，但食品安全与应用营养中心并未反对益生菌制造商提交材料中的安全性证据。

结论

作者观察到，一些制药商在收到FDA 483表的不良观察结果时，为了展现应有的谨慎勤勉，作为避免后续警告信的策略一部分，会采取召回含有不可接受微生物产品批次的便捷做法。这通常是在未就非无菌药品中发现的微生物是否真正不可接受进行全面风险评估的情况下进行的。

在缺乏全部细节的情况下，本文提出的证据表明，如果枯草芽孢杆菌在制造过程中存活，并且在产品中发现的数量少于100 cfu/mL，则不应被视为不可接受微生物。降低的水分活度、低pH值和强大的防腐体系将阻止芽孢形成细菌在口服溶液中生长。枯草芽孢杆菌不被认为是明显的病原体，并且作为严格需氧菌不会在人类肠道中增殖。这些因素降低了对所有患者群体造成细菌感染的风险。

此外，因为在药用原料中发现枯草芽孢杆菌芽孢而召回非无菌药品，这种做法过于保守，特别是考虑到其中许多原料是工业商品。需要一种更细致的方法。

参考文献

1. Cundell. A. M. 2005 Managing the microbiological quality of pharmaceutical excipients. PDA J. Pharm. Sci & Technol. 59 (6): 381-395
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3. Hong, H. A., L.H. Duc and S. M. Cutting 2005 The use of bacterial formers as probiotics FEMS Microbiol. Rev. 29: 813-835
4. Hong, H.A., J.M. Huang et al, 2008. The safety of Bacillus subtilis and Bacillus indicans as food probiotics J. Appl. Microbiol. 105: 510-520
5. Jezewska-Frackowiak, J., K. Seropczynska et al, 2018. The promises and risks of probiotic Bacillus species ABP Biochica Polonica 65(4): 509-519
6. Kubo, Y., A. P. Rooney et al 2011 Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis strains applicable to Natto (Fermented Soybean) Production Appl. Environ. Microbiol. 77(18):
7. Leistner, L 1994 Further developments in the utilization of hurdle technology for food preservation J. Food Eng, 22: 421-432
8. Rao, L., F.E. Feeherry et al, 2017 Effects of lowering water activity by various humectants on germination of spores of Bacillus species with different germinants Food Microbiology 72:112-117
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10. Sutton, S. and L. Jimenez 2012 A review of reported recalls involving microbiological control 2004-2011. Amer. Pharm. Rev. 15 (1): 42-52