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数据库Science：负责DNA跨膜转运的关键蛋白ComEC的作用机制
发布时间：2026-05-21来源：bioart
自然转化是细菌水平基因转移的核心途径之一，其核心谜题在于：带负电的亲水性
DNA
大分子如何跨越疏水的细菌内膜。
ComEC
是这一过程中的关键膜蛋白，长期以来被认为负责
DNA
的最终跨膜转运。然而，
ComEC
兼具核酸酶
（
β-
内酰胺酶样结构
域）
和推测的通道功能，这一矛盾一直未被破解
——
它如何做到既切割
DNA
又不将其完全降解？此外，由于全长
ComEC
难以纯化，其跨膜结构域的真实构象及
DNA
识别机制长期处于
未知
状态。
近日，日本东京大学
Osamu
Nureki
在
Science
期刊上发表题为
Structural basis for DNA processing and membrane translocation by
ComEC
in natural transformation
的研究论文，
通过解析细菌
DNA
转运蛋白
ComEC
的冷冻电镜结构，首次在分子层面揭示了其
“
先切割双链
DNA
中的一条链，再将剩余单链通过正电跨膜孔道导入细胞
”
的一体化工作机制，破解了该蛋白如何协调核酸酶活性与转运功能的长期谜题。
首先，为了破解
ComEC
全长结构未知的难题，
研究团队
进行了系统的蛋白筛选与工程改造。由于
ComEC
作为膜蛋白的纯化极具挑战，
团队
筛选了多种细菌同源物，最终发现来自
B.
halodurans
、
S.
decolorationis
和
S.
putrefaciens
的
ComEC
具有可溶性表达和纯化的潜力。为避免其固有的核酸酶活性在结构解析过程中降解
DNA
底物，构建了催化中心关键天冬氨酸
/
组氨酸突变
（
D/H→A
）
的酶活缺陷
型变体。利用单颗粒冷冻电镜技术，成功解析了首个无底物状态的
BhComEC
高分辨率结构
（
2.7 Å
）
。该结构清晰地揭示了其整体架构：
胞
外区由预测的
OB
折叠和
β-
内酰胺酶
样结构
域组成，膜内区则由
11
个跨膜螺旋和
4
个膜平行螺旋构成一个全新的折叠。这一基础结构的重要发现是，
尽管膜内区存在潜在的胞外和胞质侧空腔，但它们被一个中心螺旋
（
TM4
）
阻断，未形成连续孔道。
这引发了关键疑问：
DNA
转运所必需的连续孔道如何形成？
随后，为探究孔道形成的可能性，
研究团队
转向了另一个
同源蛋白
SdComEC
的结构解析。比较结构生物学显示，虽然两者整体架构相似，但
SdComEC
的跨膜区呈现了截然不同的构象：其
TM4
螺旋发生了位移，使得原本在
BhComEC
中被阻断的腔体连接起来，形成了
一个带强正电荷
的、贯穿膜的中央孔道。这一对比结果极具启发性，它表明
ComEC
的膜内区具有构象可塑性，
TM4
的移动是形成功能性
DNA
转运孔的关键开关。然而，该孔道中存在一个由疏水残基构成的狭窄瓶颈
（仅
6.4 Å
）
，且被去垢剂分子占据，
暗示此
静态构象可能并非适合
DNA
通过的开放状态。这进一步将问题指向：
DNA
的结合是否会诱导孔道转变为更开放的构象？
紧接着，为了直接观察
ComEC
如何识别其转运底物，
研究团队
解析了
SpComEC
与
ssDNA
的复合物结构。在此之前，先通过
EMSA
和
MST
等生化实验，首次在体外直接证实了纯化的全长
ComEC
能以高亲和力结合
ssDNA
。复合物结构（
2.8 Å
）显示，一段
7
核苷酸的
ssDNA
结合在
OB
与
BLL
结构域界面的正电沟槽中。结果清晰地表明，识别完全基于形状和电荷互补，而非特定序列：芳香族残基与碱基
/
糖环发生疏水堆叠，带正电残基与磷酸骨架相互作用。更重要的是，结构显示
ssDNA
的
3
’
端被精确地导向膜内孔道的入口处，而
5
’
端则朝向胞外。这一方向性完美契合了之前遗传学推测的
3
’
端先导的转运模式。通过
B. subtilis
的遗传互补实验，将结构中发现的关键残基
（如靠近孔道入口的
His219
）
进行突变，证实其确实导致细菌转化能力显著下降，从而在生理背景下验证了这些结
构观察的功能相关性。
然后，
ComEC
是
如何处理初始的
dsDNA
底物
？
MST
实验证实
ComEC
也能较弱地结合
dsDNA
。进而解析了
SpComEC
与
dsDNA
的复合物结构
（
3.2 Å
）
，这一结构带来了突破性的发现。结果显示，
dsDNA
的两条链被不对称地处理：其中一条转化链的
3
’
端被
OB
结构
域固定
并指向膜孔，其构象与
ssDNA
结合态相似；而另一条非
转化链则被
BLL
结构域捕获，其磷酸骨架被精准地定位在
BLL
的催化活性中心附近。这一结构直接可视化了
“
链选择
”
和
“
切割位点准备
”
的过程。为了验证结构观察到的切割特异性，
研究团队
设计了精妙的体外切割实验，使用不同末端
（
5
’
或
3
’
）
进行硫代磷酸修饰
（抗切割）
的
DNA
底物。实验结果与结构预测完全一致：对于
dsDNA
，
ComEC
只能切割含有天然磷酸二酯键的
5
’
端链，而对
3
’
端链无
活性，这证实了其链特异性切割机制；而对于
ssDNA
，由于柔性强，两端均可被切割。这完美解释了
ComEC
的
“悖论”
：其核酸酶活性并非用于降解底物，而是作为一种
“解旋/加工酶”
，特异性
切除非
转化链，从而将转化链释放并送入转运通道。
最后，通过整合所有结构状态
（无
DNA
、结合
ssDNA
、结合
dsDNA
）
和构象
（闭合
/
开放孔道）
，并结合多层次的功能实验数据，
研究团队
构建了一个完整的、动态的
ComEC
工作机制模型。首先，
dsDNA
被胞外域捕获，
BLL
结构域对其中
一条链进行特异性切割；随后，构象变化发生，可能由
DNA
结合或切割事件触发，导致
TM4
螺旋重排，打开跨膜孔道；最后，被释放的单链转化链沿着
OB/BLL
域界面的正电沟槽滑动，其
3
’
端在先导电荷的驱动下进入并穿过膜孔，完成
DNA
从胞外向胞质的定向转运。
综上所述，
本
研究通过精妙的实验设计，将结构快照与功能验证无缝衔接，不仅首次揭示了
ComEC
的神秘结构，
更逐步
解码了其从识别、加工到转运
DNA
的一体化机制，解决了该领域长期存在的根本性疑问。
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