穿透血脑屏障，精准靶向病灶！中国药科大学王伟教授团队【Advanced Materials】仿生纳米平台攻克缺血性中风治疗

缺血性中风致死致残率极高。现有治疗手段受限于极窄的治疗窗和血脑屏障阻碍，多数药物难以有效到达缺血病灶。研究受 4T1 肿瘤细胞脑转移时快速穿透血脑屏障和血小板靶向损伤血管的自然特性启发，开发了一种双膜融合仿生纳米平台，负载丹皮酚和聚二甲双胍用于缺血性中风治疗。

研究成果以“Blood–Brain Barrier-Penetrating and Lesion-Targeting Nanoplatforms Inspired by the Pathophysiological Features for Synergistic Ischemic Stroke Therapy”（受病理生理特征启发的血脑屏障穿透与病灶靶向纳米平台用于协同缺血性卒中治疗）为题发表在 Advanced Materials，中国药科大学药学院王伟、国家纳米科学中心梁兴杰为其共同通讯作者。

研究创新

研究将 4T1 乳腺癌细胞膜与血小板膜融合构建仿生纳米外套，包裹负载丹皮酚和聚二甲双胍的脂质体得到 PP@PCL 纳米平台。该平台同时继承了肿瘤细胞膜的血脑屏障穿透能力和血小板膜的缺血病灶靶向能力。通过多机制协同作用，包括清除活性氧、抑制神经炎症、重编程小胶质细胞表型和促进血管生成，显著减轻缺血再灌注损伤，在细胞和动物模型中均展现出优异的治疗效果。

研究摘要

缺血性脑卒中是一种可怕的血管疾病，对公共健康构成了巨大威胁。由于其复杂的病理生理特征，缺血性脑卒中发作后的现有治疗手段仍难以令人满意。血脑屏障（BBB）阻碍了药物向缺血病灶的充分递送，这在很大程度上限制了大多数抗脑卒中药物的疗效。在此，受4T1肿瘤细胞脑转移时快速穿透BBB的能力以及血小板靶向受损血管天然特性的启发，通过将4T1肿瘤细胞膜与血小板膜融合制备了一种生物源纳米外壳，并将其进一步包覆在载有丹皮酚和聚二甲双胍的脂质体表面，构建了用于缺血性脑卒中治疗的仿生纳米平台（PP@PCL）。所设计的PP@PCL能够通过靶向缺血病灶、抑制神经炎症、清除过量活性氧（ROS）、重塑小胶质细胞表型以及促进血管生成，显著减轻缺血再灌注损伤，这得益于锚定缺血性脑卒中病理生理特征的协同治疗机制。结果表明，PP@PCL在受损的PC12神经元细胞和缺血性脑卒中大鼠模型中发挥了理想的治疗效果，显著减轻了神经元凋亡、缩小了梗死体积并恢复了神经功能，为开发大有前景的脑缺血性脑卒中治疗策略带来了新见解。

设计思路

缺血性中风的病理过程涉及神经炎症、氧化应激、线粒体功能障碍等多个环节，单一药物治疗效果有限。同时血脑屏障的存在使得大多数药物难以进入脑部发挥作用。研究团队从疾病自身病理生理特征和生物体内天然存在的靶向机制中寻找灵感。4T1 乳腺癌细胞具有天然的血脑屏障穿透能力，血小板能够特异性识别并结合损伤的血管内皮。将这两种细胞膜融合可以同时获得血脑屏障穿透和缺血病灶靶向两种关键能力。选择丹皮酚和聚二甲双胍作为治疗药物，两者在抗炎症、抗氧化、神经保护和促进血管生成方面具有互补和协同作用。将疏水的丹皮酚包载于脂质体双层膜中，亲水的聚二甲双胍与透明质酸形成复合物包载于脂质体亲水内腔，再用融合的双膜包裹形成最终的纳米平台。通过体外细胞模型和体内大鼠模型，从材料表征、体外穿透与靶向、体外治疗效果、体内分布与靶向、体内治疗效果、作用机制等多个层面进行系统验证，形成完整的研究闭环。

PP@PCL 纳米颗粒的制备示意图和治疗机制示意图

图文内容

PP@PCL 纳米平台的制备与表征

为了验证所设计纳米平台的成功构建并评估其基本理化性质，研究人员对不同阶段的纳米颗粒进行了全面表征。透射电镜观察显示 PP@PCL 具有典型的核壳结构，表明双膜纳米外套成功包裹在脂质体表面。动态光散射测定其水合粒径约为 131 nm，zeta 电位约为 - 18 mV。Western blotting 证实 PP@PCL 表面保留了血小板膜的 CD47、P - 选择素和 4T1 细胞膜的 VCAM-1 等关键蛋白。药物释放实验表明在模拟缺血区域酸性环境的 pH 6.7 条件下，24 小时内丹皮酚和聚二甲双胍的累积释放量分别约为 83% 和 68%，而在生理 pH 7.4 条件下几乎没有药物释放。血清稳定性实验和溶血实验证明 PP@PCL 具有良好的生物相容性和血液循环稳定性。

Figure 1、PP@PCL 纳米颗粒的制备与表征。A) 不同制备纳米颗粒的代表性 TEM 图像。B) PP@lip 和 D) PP@PCL 的粒径分布。C) Western blotting 分析显示 PP@PCL 中存在 PM 和 CM 的典型表面生物标志物。E) pH 6.7 条件下 PAE 和 PolyMet 从 PP@PCL 的体外累积药物释放曲线。F) CLSM 图像显示 DiI 标记的 PCM 纳米外套和 C6 标记的脂质体重叠。G) PP@lip 和 PP@PCL 的 zeta 电位。H) PP@PCL 的体外血清稳定性测试。I) FRET 研究表明 PM 和 CM 发生融合，J) 其定量分析。K) 不同浓度 PP@PCL 的溶血实验。

体外血脑屏障穿透性和靶向能力

为了评估 PP@PCL 穿越血脑屏障并靶向缺血病灶的能力，研究人员建立了基于 transwell 的体外血脑屏障模型。结果显示与普通脂质体相比，PP@PCL 表现出显著增强的血脑屏障穿透能力，更多的纳米颗粒能够穿过 bEnd.3 细胞单层到达下层的 OGD/R 损伤 PC12 细胞。细胞摄取实验表明 PP@PCL 能够被 bEnd.3 细胞和损伤的 PC12 细胞有效内化。免疫逃逸实验显示 PP@PCL 能够显著减少巨噬细胞的吞噬，这有利于延长其在血液循环中的时间。三维细胞球穿透实验进一步证实 PP@PCL 能够更深地穿透进入 bEnd.3 细胞球内部，表明其具有优异的血脑屏障穿透潜力。

Figure 2、PP@PCL 的体外靶向能力和血脑屏障穿透性研究。A) 体外血脑屏障模型构建示意图。B) 使用 transwell 介导的血脑屏障模型，不同 C6 标记的纳米颗粒在 OGD/R 处理的 PC12 细胞中的细胞摄取行为。C) CLSM 图像显示 RhB 标记的 PCL 纳米颗粒在 OGD/R 处理的 PC12 细胞中的细胞内运输。D) 通过研究 RAW264.7 巨噬细胞对不同 C6 标记纳米颗粒的内化来评估其免疫逃逸能力。E) CLSM 图像显示不同 RhB 标记的纳米颗粒与 DiO 标记的 bEnd.3 内皮细胞孵育 30 分钟后的结合相互作用。

体外治疗效果和作用机制

为了验证 PP@PCL 的体外治疗效果，研究人员使用 OGD/R 处理的 PC12 细胞作为缺血性中风体外模型。活死细胞染色和 MTT 实验表明 PP@PCL 能够显著提高损伤 PC12 细胞的存活率，减少细胞死亡。LDH 释放实验和细胞凋亡检测证实 PP@PCL 能够有效保护 PC12 细胞免受 OGD/R 诱导的损伤，显著降低细胞凋亡率。氧化应激是缺血再灌注损伤的重要机制之一，ROS 检测结果显示 PP@PCL 具有强大的活性氧清除能力。JC-1 探针检测表明 PP@PCL 能够有效恢复受损的线粒体膜电位，减轻线粒体功能障碍。此外，PP@PCL 还能够促进损伤 PC12 细胞的迁移能力，有利于神经修复。

Figure 3、体外抗缺血再灌注损伤的机制和治疗效果。A) 不同处理 24 小时后，OGD/R 处理的 PC12 细胞的 Calcein-AM/PI 双染色 CLSM 图像。B) MTT 法测定不同处理 24 小时后 OGD/R 处理的 PC12 细胞的细胞活力。C) 损伤 PC12 细胞中的 LDH 释放。D) Annexin V-FITC/PI 双染色法检测损伤 PC12 细胞的凋亡，E) 其定量分析。F) OGD/R 处理的 PC12 细胞的 TUNEL 染色 CLSM 图像。G) PC12 细胞中 ROS 水平的荧光图像，H) 其流式细胞术定量分析。

小胶质细胞表型调控和抗炎作用

小胶质细胞的过度激活和向促炎 M1 表型极化是缺血性中风后神经炎症的主要原因。研究人员使用 OGD/R 处理的 BV2 小胶质细胞模型评估 PP@PCL 对小胶质细胞表型的调控作用。免疫荧光染色结果显示 PP@PCL 能够显著降低 M1 型小胶质细胞标志物 CD16/32 的表达，同时提高 M2 型小胶质细胞标志物 CD206 的表达，有效促进小胶质细胞从促炎 M1 表型向抗炎 M2 表型转化。ELISA 检测结果表明 PP@PCL 能够显著减少 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等促炎细胞因子的分泌，有效抑制神经炎症反应，为神经元提供一个有利的修复微环境。

Figure 4、体外神经保护作用和小胶质细胞表型调节。A) 不同处理 24 小时后，OGD/R 处理的 PC12 细胞中线粒体膜电位的变化，B) 其定量分析。C) 不同处理 24 小时后，OGD/R 处理的 BV2 细胞中 M1 标志物 CD16/32 和 D) M2 标志物 CD206 的代表性免疫荧光图像。E-G) 不同处理 24 小时后，OGD/R 处理的 BV2 细胞中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的细胞因子水平。

体内靶向性和生物分布

为了评估 PP@PCL 在体内的靶向能力和生物分布，研究人员建立了大鼠大脑中动脉闭塞 / 再灌注（MCAO/R）模型。静脉注射不同 DiR 标记的纳米颗粒后，通过活体荧光成像系统实时监测纳米颗粒在脑部的积累情况。结果显示 PP@PCL 在缺血侧大脑的荧光信号最强，并且能够持续 24 小时以上。与普通脂质体相比，PP@PCL 在脑部的积累量提高了约 2.9 倍。离体器官成像进一步证实 PP@PCL 主要富集在缺血侧大脑，而在其他主要器官中的分布相对较少。药代动力学研究表明 PP@PCL 具有更长的血液循环半衰期，这有利于其更多地到达缺血病灶发挥治疗作用。

Figure 5、PP@PCL 纳米颗粒在 MCAO/R 大鼠中的体内靶向能力和生物分布。A) 静脉注射不同 DiR 标记的纳米颗粒后，在主要时间点 MCAO/R 大鼠头部的 NIR 荧光图像。B) 各组 MCAO/R 大鼠大脑中平均辐射效率随时间变化的定量分析。C) 注射后 12 和 24 小时脑切片的荧光图像，D) 其定量分析。E) 注射后 24 小时解剖的主要器官和大脑的荧光图像，F) 其定量分析。G) 不同注射后随时间收集的 MCAO/R 大鼠血液样本的荧光图像，H) 其定量分析。

体内治疗效果

基于 PP@PCL 优异的体内靶向能力，研究人员进一步评估了其在 MCAO/R 大鼠模型中的治疗效果。激光散斑成像显示 PP@PCL 能够显著促进缺血区域的脑血流恢复。TTC 染色结果表明 PP@PCL 治疗后大鼠的脑梗死体积仅为 8.5%，远低于生理盐水组和其他对照组。脑含水量测定显示 PP@PCL 能够有效减轻脑水肿。TUNEL 染色和 NeuN 免疫荧光染色证实 PP@PCL 能够显著减少缺血区域的神经元凋亡，增加存活神经元的数量。ROS 检测结果表明 PP@PCL 在体内同样具有强大的活性氧清除能力。CD31 免疫荧光染色显示 PP@PCL 能够促进缺血区域的血管生成，改善脑微循环。Nissl 染色和 H&E 染色进一步证实 PP@PCL 能够有效保护神经元的形态和结构，减轻脑组织的病理损伤。

Figure 6、体内抗缺血性中风治疗效果。A) MCAO/R 大鼠的治疗方案示意图。B) 不同处理后 MCAO/R 大鼠的代表性激光散斑图像。C) 不同处理后中风病灶平均血流量的定量分析。D) 不同处理后代表性 TTC 染色的脑切片。E) 基于 TTC 染色脑切片的脑梗死体积定量分析。F) 脑含水量的定量分析。G) 不同处理后缺血半暗带的代表性 TUNEL 染色图像，H) 其定量分析。

Figure 7、不同处理后缺血脑切片的免疫荧光分析。A) 不同处理后非缺血和缺血区域的代表性 NeuN 染色图像，B) 其定量分析。C) 不同处理后缺血脑病灶中代表性 ROS 水平，D) 其定量分析。E) 不同处理后缺血脑病灶中代表性 CD31 染色图像，F) 其定量分析。G) 不同处理后皮质和海马区缺血脑切片的代表性 Nissl 染色，(H, J) 其定量分析。I) 不同处理后缺血脑切片的代表性 H&E 染色。

体内治疗机制研究

为了深入探究 PP@PCL 的体内治疗机制，研究人员分析了其对缺血脑组织中小胶质细胞和巨噬细胞表型的影响。免疫荧光染色结果显示 PP@PCL 能够显著减少缺血区域 M1 型小胶质细胞的数量，同时增加 M2 型小胶质细胞的数量。流式细胞术分析表明 PP@PCL 能够减少外周单核细胞 / 巨噬细胞向缺血脑组织的浸润，并且促进巨噬细胞从 M1 型向 M2 型转化。Western blotting 分析显示 PP@PCL 能够上调抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达，下调促凋亡蛋白 Bax 和 cleaved caspase-3 的表达，抑制神经元凋亡通路。氧化应激相关指标检测表明 PP@PCL 能够降低 MDA 含量，提高 SOD 活性，有效减轻氧化应激损伤。ELISA 检测结果证实 PP@PCL 能够显著降低缺血脑组织中促炎细胞因子的水平，抑制神经炎症反应。

Figure 8、对重塑缺血微环境的影响。A) 代表性免疫荧光染色检测 Iba-1 + 和 CD16/32 + 细胞以确定 M1 样小胶质细胞，C) 其定量分析。D) 代表性免疫荧光染色检测 Iba-1 + 和 CD206 + 细胞以确定 M2 样小胶质细胞，E) 其定量分析。B) 小胶质细胞极化和 M2 样小胶质细胞在神经保护中作用的示意图。F) 不同处理后缺血脑组织中 CD11b+CD45high 单核细胞 / 巨噬细胞的代表性 FCM 图，G) 其定量分析。H) 不同处理后缺血脑组织中巨噬细胞表型的代表性 FCM 图，I) 其定量分析。

长期神经功能恢复和分子机制

为了评估 PP@PCL 对缺血性中风后长期神经功能恢复的影响，研究人员进行了 Morris 水迷宫实验和神经功能缺损评分。结果显示 PP@PCL 治疗能够显著改善大鼠的学习能力和空间记忆能力，降低神经功能缺损评分。全基因组 RNA 测序分析揭示了 PP@PCL 治疗后缺血脑组织中基因表达谱的变化。与生理盐水组相比，PP@PCL 组有 3214 个差异表达基因，其中 2788 个上调，456 个下调。KEGG 通路富集分析表明这些差异表达基因主要参与钙信号通路、神经活性配体 - 受体通路、PI3K-Akt 信号通路等与神经保护和抗炎相关的信号通路，从分子水平进一步验证了 PP@PCL 的治疗机制。

Figure 9、不同处理后 MCAO/R 大鼠的抗炎机制和长期神经功能缺损评估。A) 不同处理后缺血脑组织中 cleaved caspase-3、Bax 和 Bcl-2 蛋白表达的代表性 Western blotting 分析。B) 不同处理后缺血脑组织中的 MDA 含量和 C) SOD 含量。D) ELISA 技术检测不同处理后缺血脑组织中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的细胞因子水平。E) 指示大鼠学习和记忆能力的代表性游泳路径。F) MWM 测试测定 MCAO/R 后 7-11 天不同处理后的逃避潜伏期。G) 移除平台后在目标象限花费的时间，H) 不同处理大鼠在 MCAO/R 后 11 天穿越移除平台的次数。I) 各组大鼠的游泳速度。J) mNSS、K) Bederson 和 L) Longa 评分评估不同处理后的神经功能缺损。

Figure 10、不同处理后缺血脑组织的 RNA-seq 分析。A) 不同处理 24 小时后缺血脑样本中差异表达基因的总结。B) 不同比较中差异表达基因的火山图。C-E) 不同治疗组与生理盐水组相比前 20 个富集通路的 KEGG 分析。F) 不同处理后聚类差异表达基因的热图。

文献信息

Blood–Brain Barrier-Penetrating and Lesion-Targeting Nanoplatforms Inspired by the Pathophysiological Features for Synergistic Ischemic Stroke Therapy

Lu Tang, Yue Yin, Hening Liu, Mengliang Zhu, Yuqi Cao, Jingwen Feng, Cong Fu, Zixuan Li, Weijie Shu, Jifan Gao, Xing-Jie Liang, Wei Wang

Advanced Materials, 2024, 36, 2312897

https://doi.org/10.1002/adma.202312897