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数据库Science：从头设计蛋白WRAPs——轻松解决膜蛋白的溶解与结构测定难题
膜蛋白
构成近三分之一的蛋白质组，
在细胞信号传导、病原体感染及药物反应中发挥着核心作用
。
同时也是最难生产和研究的蛋白质之一，因为疏水表面导致
其
在脱离膜环境后极不稳定。鉴于这些蛋白质嵌入在脂质膜中，它们的提取依赖于去垢剂。这是一个繁琐的多步骤过程，需要大量的优化，且往往会损害蛋白质的稳定性并使下游分析变得复杂。例如，引起梅毒的革兰氏阴性细菌——梅毒螺旋体
（
Treponema pallidum
）
的外膜蛋白是极具潜力的疫苗候选物。然而，它们很难在大肠杆菌
（
E
coli
）
中表达，若能实现无去垢剂的溶解，将有助于单克隆抗体的发现和疫苗设计。
对膜蛋白进行重新
设计
，使其以可溶形式表达，可以
绕过使用去垢剂从膜中常规提取的需求。大多数现有的重新设计方法依赖于改变天然蛋白序列，通过人工操作或计算方法将面向脂质的疏水残基突变为极性氨基酸。
SIMPLEx
（高表达水平的整合膜蛋白溶解）
方法利用两亲性载脂蛋白
AI
（
Apo-AI
）
和可溶性诱饵与膜蛋白进行基因融合，通过非特异性疏水相互作用屏蔽面向脂质的疏水区域，从而在不改变天然序列的情况下赋予其水溶性。然而，
Apo-AI
的柔韧性以及与被屏蔽靶标之间相互作用的非特异性，可能会使结构解析变得复杂。
近
日
，
来自
华盛顿大学
的
David Baker
团队
合作
在
Science
杂
志上发表文章
Membrane protein solubilization
and structure determination using
de novo–designed proteins
，
开发出一种基于深度学习的通用设计方法，该方法能够在保留天然膜蛋白序列、折叠、活性位点和配体结合特性的同时，使膜蛋白溶解。
遗传编码的从头设计蛋白
WRAPs
——
能够包裹与脂质相互作用的疏水表面，使其在无需使用去垢剂的情况下即可保持热稳定性和水溶性。
在
单体和寡聚
的
β-
桶状外膜蛋白以及多次跨膜的
α-
螺旋蛋白
成功使用
WRAPs
得到了可溶性蛋白
。
对
WRAP
包裹的分枝杆菌孔蛋白
进行
冷冻电子显微镜
（
cryo-EM
）
结构
解析，分辨率为
2.95
，即
WRAPs
可用于
可溶
状态下膜蛋白的结构解析。
利用
WRAPs
生成了梅毒螺旋体
（
Treponema
pallidum
）
抗原的可溶性版本
，为
进一步
梅毒疫苗开发
提供可能
。
在初步实验中，
研究人员
发现引导目标膜蛋白末端的自由扩散来完全保护所有面向脂质的疏水区域。转而采用一种两步法：首先为
WRAPs
生成理想化的从头设计的
α-
螺旋和
β-
桶状骨架，使其大致匹配目标蛋白跨膜部分的直径和高度。利用折叠条件
RFdiffusion
生成内径与目标蛋白跨膜区域兼容的圆柱形反平行螺旋组装体。为了生成
β-
桶状骨架，采用参数化方法构建了理想骨架，通过选择
β-
折叠链的长度和数量以及桶的剪切值来生成具有适当内径和桶高度的骨架，以便在维持桶内链间氢键的同时，容纳与目标蛋白的侧链堆积相互作用。
接下来，利用部分扩散对设计的骨架进行优化，使其在形状和侧链相互作用上与目标蛋白互补。使用
PyMOL
或
PyRosetta
将目标蛋白定位在设计好的螺旋或桶状
WRAP
骨架的中心。随后，使用部分扩散方法对从头设计的骨架进行塑形，通过部分随机化设计骨架的坐标，并使用基于靶结构条件的
RFdiffusion
连续去除噪声。通过这种条件约束，预期得到的优化骨架在形状互补性上将与蛋白质数据库
（
PDB
）
中典型的蛋白
-
蛋白界面一样好。然后，使用专门针对可溶性蛋白的
ProteinMPNN
版本
（
SolubleMPNN
）
来为优化后的骨架设计序列，在固定目标膜蛋白残基的氨基酸种类但不固定其侧链构象的情况下，产生能够引导折叠到所需结构并特异性与靶蛋白相互作用的序列。随后，使用
AlphaFold2
(AF2)
来选择预测能折叠成目标结构的设计，以进行实验表征。
外膜蛋白
（
OMPs
）
是存在于革兰氏阴性菌
中的跨膜
β-
桶状蛋白
，在重组表达时，除了需要使用去垢剂进行纯化外，还需要从包涵体中进行复性
。研究人员利用
WRAPs
来构建可溶解的大肠杆菌外膜蛋白
A
（
OmpA
）
。为
Omp
A
生成
α-
螺旋和
β-
桶状两种
WRAPs
，并将
WRAP-
OmpA
作为单基因融合蛋白在大肠杆菌细胞质中表达。成功从大肠杆菌裂解液的可溶组分中纯化了
α-
螺旋和
β-
桶状
WRAP-
OmpA
蛋白。在六个
N
端融合的
α-
螺旋
WRAP-
OmpA
设计中有五个是可溶的，六个
C
端融合的
β-
桶状
WRAP-
OmpA
设计中有一个是可溶的
。且这两种设计均具有正确的折叠，且在
9
5
°
C
下保持稳定
。使用冷冻电镜对
α-
螺旋
（
61.2
kDa
）
和
β-
桶状
（
41.4
kDa
）
WRAP
包裹
的
OmpA
的结构进行表征
，显示出结构的完整性。进一步实验显示，
WRAP
构建体保留了抗体识别元件以及与天然配体几丁二糖的结合能力。克服了传统膜蛋白解析过程中，由于
去除去垢剂需要增加活化能
（加热）
，膜蛋白配体和辅因子在天然质谱分析中经常会丢失
，这一限制。即
计算流程可以生
成定制的
α-
螺旋或
β-
桶状
WRAP
结构域，从而产生可溶且热稳定的目标跨膜蛋白版本。
β-
桶状
WRAPs
需要显著更多的计算资源才能达到相似的
AF2
评估指标，这可能是因为在
维持与靶标互补界面的同时，满足链间氢键的几何约束以形成正确的桶状结构具有较大难度。因此，在后续对其他靶标的设计中，
研究人员
主要专注
于
α-
螺旋
WRAPs
的设计。
随后，研究人员生成
WRAPs
成功得到梅毒
螺旋体苍白亚种
（
Tp
）
外膜蛋白的溶解
版本。利用长期感染
Tp
的兔子血清证实，保留对
WRAP
-
Tp
外膜蛋白的反应性。提示溶解版本的
WRAP
-
Tp
外膜蛋白可作为抗原，有助于
产生、分离和表征单克隆抗体，并有望作为梅毒疫苗的组成部分。
通过产生溶解版本的菱形蛋白酶
GlpG
和趋化因子受体
CXCR
4
来进一步证实，
经
WRAP
包裹的多次跨膜螺旋蛋白保留了酶活性位点和配体结合特性
。
耻垢分枝杆菌
（
Mycobacterium smegmatis
）
孔蛋白
A
（
MspA
）
是一种高导电性的八聚体同源寡聚物，被广泛应用于纳米孔
DNA
测序
。利用
WRAP
对不溶性扩膜结构域进行包裹，可产生可溶性的蛋白，并完成结构解析。即
可以使用
WRAPs
溶解寡聚蛋白，并且
WRAP
平台能够实现溶液中膜蛋白的高分辨率结构测定。
总的来说，
这项研究
提供了
无需修改天然序列、且维持结构完整性和关键功能位点的膜蛋白溶解技术——
WRAP
。
WRAPs
展现出广泛的应用潜力，包括促进生化表征、结构解析、药物发现，以及开发保留抗原表位的可溶性蛋白以用于疫苗设计。
原文链接：
science.adr3817
