Nature：清华大学王海峰团队开发新型基因敲入技术，无需切断DNA双链，高效精准敲入大片段基因

发布时间：2026-07-25来源：生物世界

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

可编程基因敲入在治疗遗传性疾病和推动细胞疗法方面具有巨大潜力。然而，实现精确且高效的千碱基尺度DNA片段整合仍面临挑战。

2026 年 7 月 22 日，清华大学王海峰研究员团队（郜艳敏、马宇、于可欣、刘印天为论文共同第一作者）在 Nature 期刊发表了题为：Efficient and precise programmable DNA knock-in without double-strand breaks 的研究论文。

该研究开发了一种新型 CRISPR 技术——KNIT editing（Kilobase-scale Nickase-targeting editing），通过切口酶在目标 DNA 位点制造单链切口，在不造成 DNA 双链断裂的情况下，实现高效率、精准的大片段 DNA 敲入（效率可达 89%，片段长度可达 10.5 kb），实现了高编辑效率和低水平的非预期脱靶效应的兼顾。研究团队进一步验证了 KNIT editing 技术在遗传疾病治疗和构建 CAR-T 细胞抗肿瘤的临床相关应用。

可编程且精确地整合千碱基尺度 DNA 序列，有望用于治疗遗传疾病和癌症。对于由特定基因中多种突变引起的许多遗传疾病，一种通用的治疗策略是将能够补偿致病突变的转基因整合到安全港位点或天然基因座中，以实现持续表达。然而，如何高效、精准地进行可编程基因敲入，又同时避免意外后果，仍面临挑战。

基于核酸酶的基因敲入方法会产生 DNA 双链断裂（DSB），从而可能导致插入或缺失（indel）、染色体易位、脱靶效应以及致癌风险，限制了其在疾病治疗中的应用。为解决这些问题，需要开发不依赖 DNA 双链断裂的策略来进行治疗性的基因敲入。

CAR-T 细胞等免疫细胞疗法为癌症治疗提供了强有力的策略。然而，传统的慢病毒或逆转录病毒载体介导的 CAR 递送会，导致基因组随机整合，带来潜在致癌风险，已有少数病例报告显示患者出现继发性 T 细胞淋巴瘤。

在特定位点进行非病毒载体递送的、可编程的 CAR 整合，则提供了一种替代方案。但目前的方法仍依赖于 DNA 双链断裂（DSB），这会增加基因组不稳定性及致癌风险。迄今为止，无需 DNA 双链断裂的非病毒递送策略用于可编程的 CAR-T 细胞工程，仍鲜有探索。

相比 DNA 双链断裂，DNA 单链切口的致突变性较低，但其长期以来被认为在同源定向修复（HDR）介导的基因编辑中效率不足。目前基于 DNA 单链切口的 DNA 编辑策略（例如先导编辑技术）大多依赖于额外的酶，而非 HDR 机制。

在这项新研究中，研究团队提出，仅使用一种切口酶且不添加其他 DNA 修饰酶，即可增强 DNA 单链切口位点的 HDR 效率，从而有助于实现精准的基因敲入，同时最大限度减少额外 DNA 酶带来的潜在不良影响。此前的研究已在改善 DNA 单链切口 HDR 方面取得显著进展，包括实现基因大小的 DNA 插入。然而，这些策略仍较为有限，且尚未得到充分探索。

研究团队系统性筛选了提高 DNA 单链切割位点基因敲入效率的策略，发现将 DNA 供体招募至单链切割位点，可显著提升基因敲入效率。基于这一发现，研究团队开发了一种新型 CRISPR 编辑工具——KNIT editing（Kilobase-scale nickase-targeting editing），可在不切断 DNA 双链的情况下，实现高效、精确且可编程的千碱基尺度的 DNA 敲入，该工具通过将 Cas9（D10A）切口酶与 DNA 供体招募系统相结合而实现。

具体来说，KNIT editing 使用切口酶，只切开 DNA 一条链，形成单链切口；切口酶与单体链霉亲和素（mSA）融合，同时制备生物素（biotin）修饰的双链 DNA（dsDNA）供体，mSA 会把生物素修饰的 DNA 供体锚定在切口附近，从而极大程度上促进了同源定向修复（HDR）介导的精准基因敲入。

KNIT editing 技术可实现 0.7 kb 至超过 10 kb 的大片段 DNA 的可编程整合，并在不同基因组位点和细胞类型中均表现出良好效果。该技术的效率高达 89%，并显著降低了非预期的插入-缺失突变（indel）、染色体易位以及脱靶编辑的发生率。该技术还支持重复基因敲入编辑以及最小易位的多基因座基因敲入。研究团队还进一步优化出了增强版的

第二代 KNIT editing 技术（KE2），能够在靶位点招募多个 DNA 供体，通过单次转染进一步提高靶向基因敲入效率。

研究团队进一步验证了 KNIT editing 技术的应用，在携带溶酶体酸性脂肪酶缺乏症（LAL-D）相关的 LIPA 基因突变的细胞中，KNIT editing 正确将 LIPA 的 cDNA 精准敲入到了 AAVS1 安全港位点，效率高达 64.0%，是 Cas9 的 5.5 倍，并恢复了其正常基因表达。此外，研究团队还将其精准敲入到了其天然基因位点，使其受到内源调控，在突变细胞中恢复了 39% 的内源性表达水平。

值得注意的是，研究团队进一步证明，KNIT editing 技术能够在不产生 DNA 双链断裂的情况下，实现非病毒递送的、可编程的 CAR-T 细胞工程化改造，将 CD19 CAR 精准敲入临床应用的 TRAC 位点，平均效率达 32.9%，最高达 40.6%，同时降低了 indel、染色体易位和脱靶等非预期编辑事件。此外，KNIT editing 的原代 T 细胞存活率高达 69.7%，远超 Cas9 的 16.1%。使用该技术构建的工程化 CAR-T 细胞保持了良好的增殖能力，并在体外和小鼠模型中均表现出有效的抗肿瘤活性。