【JMC】中国药大孙昊鹏/南中医陈瑶/烟大刘宗亮：AKR1C3靶向小分子药物偶联物，双靶依赖精准化疗新策略

近日，中国药科大学孙昊鹏、南京中医药大学陈瑶、烟台大学刘宗亮等在药物化学权威期刊Journal of Medicinal Chemistry上发表了一篇题为"靶向AKR1C3的组织蛋白酶B激活型小分子药物偶联物的设计、合成及生物活性评价——以增强化疗选择性"的研究论文，报道了一类靶向醛酮还原酶家族1成员C3（AKR1C3）的组织蛋白酶B（CTSB）激活型小分子药物偶联物（SMDC）的设计、合成与生物活性评价。研究团队以此前开发的高选择性AKR1C3抑制剂S19−1011为靶向配体骨架，采用已获批ADC药物Zynlonta中使用的Val−Ala二肽作为CTSB响应性可裂解连接子，以吉西他滨（GEM）为细胞毒性载荷，通过四轮结构优化最终获得最优化合物SM-27。该化合物对AKR1C3表现出纳摩尔级抑制活性（IC₅₀ = 9 ± 2 nM），并在CTSB介导下高效释放载荷。尤为关键的是，SM-27的抗肿瘤活性呈现对AKR1C3与CTSB的双重依赖性——仅在两种蛋白高共表达的肿瘤细胞中发挥强效杀伤作用，而对正常细胞毒性极低。在HepG2肝癌异种移植模型中，SM-27静脉给药展现出优于吉西他滨的抑瘤效果（TGI: 76.27% vs 62.55%），且体重无显著下降、主要脏器未见明显损伤；其口服生物利用度达45.68%，远高于吉西他滨（<10%），并通过掩蔽胞苷脱氨酶（CDA）代谢位点有效规避了首过代谢失活。该研究为以胞内蛋白为靶点的SMDC设计提供了新范式，有望为解决化疗药物的脱靶毒性难题提供有前景的研究策略。

图文摘要

01

研究背景

传统化疗药物肿瘤选择性差、毒副作用明显，精准医学时代催生了ADC、PDC、SMDC等药物递送策略。SMDC由小分子靶向配体、连接子和载荷组成，兼具肿瘤穿透力强、体内稳定性高、成本低及免疫原性弱等优势，但尚无产品上市。当前SMDC研究多聚焦膜蛋白靶点，而胞内蛋白靶点研究较少；靶向AKR1C3的AST-3424和靶向HSP90的PEN-866等胞内靶向偶联物已进入II期临床，提示胞内癌蛋白可作为SMDC理想靶点。AKR1C3在多种恶性肿瘤中高表达，兼具醛酮还原酶和硝基还原酶活性，AST-3424正是利用后者实现载荷精准递送，但存在连接子裂解机制单一、易被其他硝基还原酶干扰、载荷谱窄及脱靶毒性风险等局限。本研究以高选择性AKR1C3抑制剂S19−1011（IC₅₀ = 26.11 nM，选择性>383倍）为靶向配体，采用CTSB特异性识别且已应用于上市ADC药物Zynlonta的Val−Ala二肽连接子，以5-FU衍生物或GEM为载荷，设计合成了一系列作用机制区别于AST-3424的新型SMDC。经四轮结构优化，最终获得最优化合物SM-27，其对AKR1C3抑制活性达9 ± 2 nM，对HCC细胞IC₅₀为1.60 ± 0.59 μM，在异种移植模型中显著抑瘤且无明显脱靶毒性，为化疗脱靶问题提供了有前景的研究策略。

①靶向AKR1C3的CTSB激活型SMDC的设计与合成

UMB298与CBP溴结构域的共晶结构（PDB: 7KPY）显示，其3,5-二甲基异噁唑基团深嵌于KAc选择性识别口袋，环己基部分通过范德华力与CBP溴结构域相互作用，3-氯-4-甲氧基苯基与Arg1173形成阳离子-π相互作用，而咪唑并[1,2-a]吡啶骨架则夹在守门残基Val1174与Leu1120之间，作为锚定基团使其余三部分嵌入相应口袋或表面。基于对CBP30和CCS1477的系统构效关系研究，作者总结出两条设计规则：一是对两个亚甲基单元施加适当的构象约束可有效提高结合亲和力和抑制活性；二是在各类构象受限基团中，引入内酰胺环（特别是吡咯烷-2-酮和哌啶-2-酮）最为有利。例如，将CBP30中的两个亚甲基替换为氮杂环丁烷-2-酮环得到的化合物1u，其细胞活性提升了2至3倍（OPM-2 IC₅₀从2.64 μM降至1.09 μM）。据此，作者提出对UMB298实施环化策略，以哌啶-2-酮环替代其两个亚甲基单元，预期该修饰可降低结合熵损失，并通过内酰胺羰基引入与CBP溴结构域Arg1173的额外氢键受体作用，从而增强结合亲和力与生物活性；同时，由于这两个亚甲基单元邻近芳环且为代谢软位点，以耐代谢的内酰胺环替代亦可改善化合物的代谢稳定性。

②AKR1C3酶抑制活性测定与构效关系研究

先导筛选显示SM-01对AKR1C3的IC₅₀为0.48 μM，而SM-02几乎完全失活，分子对接证实间位引入连接子可保留配体结合构象，对位引入则导致显著偏离；双配体SM-03因空间位阻活性降低7倍，无连接子SM-04刚性增强反而结合更稳定，综合确定SM-01为先导。一类同系物表明连接子延长使异噁唑偏离SP1口袋、丧失Ser118氢键，活性逐渐下降。二类同系物中A环取代位点显著影响活性，4-甲氧基SM-14最优（IC₅₀ = 0.04 μM），其甲氧基使配体偏转、A环嵌入SP1并增强与Phe306的π−π作用；硝基SM-11因可作为氢键受体与Ser118结合且避免配体翻转，活性提高7倍；乙氧基则因位阻过大导致活性下降。三类同系物转向B环修饰，5位取代优于4位和2位，5-甲氧基SM-22活性达3 nM，超越先导S19−1011，其甲氧基增强B环T形π−π作用并引入额外疏水作用，且不影响异噁唑与SP1的结合；A/B环双取代未进一步改善。四轮优化后将载荷替换为GEM得到SM-25至SM-28，SM-27活性为9 nM，略低于母体SM-22，分子对接显示其结合模式与SM-22高度相似，但GEM引入导致Trp86-B环π−π作用消失及氢键切换；MD模拟证实两者蛋白构象稳定，SM-27因GEM柔性更高而RMSD波动更大，核心配体区域则始终稳定。SM-22和SM-27确定为最优化合物，图9总结了28个分子的构效关系框架。

③化合物理化性质的测定 

本研究测定了8个高活性化合物（IC₅₀ < 100 nM）的水溶性和log P，结果显示含GEM载荷的SM-25至SM-28水溶性（约100 μg/mL）显著优于含5-FU衍生物的SM-11/14/22/23（提高约5倍），且log P值（1−2）更符合成药性要求。血浆稳定性评价中，SM-22和SM-27在小鼠和人血浆中24 h残留率分别超过75%和80%，仅二肽C端发生轻微裂解释放GEM；鉴于两化合物体内半衰期短、血浆滞留不超过24 h，实际脱靶风险极低，为其体内疗效和安全性提供了保障。

④体外活性评价

BET家族包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT，每个蛋白含两个串联溴结构域。为排除BET抑制导致的脱靶效应，作者以AlphaScreen法评估12和CZL-105对BRD2-4的抑制活性，并以TSA评估其对12种非BET溴结构域的结合谱。结果显示，12和CZL-105在1 μM下对BET溴结构域无活性，CZL-105对其他非BET溴结构域也无稳定化作用，选择性显著优于双靶点抑制剂NEO2734。分子对接预测CZL-105与CBP的结合模式与UMB298相似：异噁唑深嵌KAc口袋，与Asn1168形成两个氢键、与Tyr1125形成水介导氢键；哌啶-2-酮羰基与Arg1173形成额外氢键，该相互作用在UMB298中不存在。100 ns分子动力学模拟显示体系约10 ns后达动态平衡，RMSD维持在0.3 nm以下，氢键数目1-5个波动，自由能景观呈单一全局能量最小值，表明结合构象高度稳定。

图片来源：ACS

⑤SM系列化合物作用机制研究

RNA测序分析显示化合物12下调了铁死亡关键调控因子SLC7A11的表达。为探究p300/CBP溴结构域抑制与铁死亡的关联，作者评估了CZL-105对OPM-2细胞铁死亡过程的影响。结果显示，CZL-105以剂量依赖性方式显著降低SLC7A11表达并增加脂质活性氧（ROS）积累，但使用经典铁死亡抑制剂Fer-1和Lip-1的挽救实验未能逆转CZL-105诱导的细胞死亡，表明尽管p300/CBP溴结构域抑制调控了铁死亡相关事件，CZL-105在OPM-2细胞中诱导的细胞死亡并非主要通过经典铁死亡途径执行。鉴于已有研究表明p300/CBP抑制或降解可触发细胞周期阻滞和凋亡，作者进一步考察了CZL-105对这些过程的影响。结果显示，CZL-105诱导了G0/G1期阻滞和凋亡，且呈时间和剂量依赖性；Western blot分析显示CZL-105显著升高cleaved caspase-3和cleaved PARP水平，同时pro-caspase-3和全长PARP略有降低，支持其诱导凋亡的作用。综上，CZL-105通过p300/CBP溴结构域抑制在OPM-2细胞中诱导G0/G1期阻滞和凋亡，从而抑制细胞生长。

⑥体内药代动力学与抗肿瘤活性评价

大鼠体内药代动力学研究显示，SM-27经静脉（2 mg/kg）和灌胃（5 mg/kg）给药后具有适于体内应用的PK性质：消除半衰期适中（i.v. t₁/₂ = 3.45 h；i.g. t₁/₂ = 4.27 h），系统清除率低（i.v. CLz = 0.02 L/h/kg），确保了稳定的体内药物暴露。其口服生物利用度达45.68%，较GEM（通常<10%）大幅提升，显著增强了口服给药的临床转化潜力。口服生物利用度提高的核心机制包括：（1）AKR1C3配体部分的疏水修饰使SM-27 log P（1.08）显著高于GEM，更适配胃肠上皮细胞脂质双层结构，通过被动扩散实现更高效的跨肠上皮转运，这与口服给药后高血浆暴露和适宜达峰时间一致；（2）SM-27通过连接子直接偶联GEM的4-NH₂位点，精确遮蔽了胞苷脱氨酶（CDA）的催化位点，有效规避该酶在肝脏和肠壁组织中的代谢降解，其口服给药后低清除率与静脉给药相当，进一步确保了有效体内药物暴露。在HepG2异种移植肝癌模型中，SM-27静脉和灌胃给药均表现出良好抗肿瘤活性：持续给药期间各SM-27处理组小鼠体重无显著下降，而GEM组出现明显体重降低，提示SM-27具有更优的体内安全性和耐受性。等效剂量下，SM-27静脉给药抑瘤率（TGI: 76.27%）优于GEM（62.55%）；SM-27灌胃给药（TGI: 60.24%）虽低于直接静脉注射，但仍与GEM相当，显示其口服递送潜力。H&E染色显示SM-27未对小鼠心、肝、脾、肺、肾造成显著损伤，表明其具有高组织安全性和耐受性。单剂量急性毒性实验初步确定SM-27静脉给药最大耐受剂量≥250 mg/kg，远高于HepG2模型中治疗剂量（2 mg/kg），提示其具有较宽的治疗安全窗。

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https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c00881