广医RRBS揭示DNA甲基化在肿瘤治疗应激研究中的关键作用

2026年6月26日，广州医科大学附属第二医院（广医二院）微创介入科陈烨博士等为第一作者、黄文薮副教授和蔡明岳副教授等为共同通讯作者，在中科院1区TOP期刊《Molecular Therapy》发表题为“HSP90α-USP7-DNMT1 Axis Drives Hepatocellular Carcinoma Recurrence After Microwave Ablation by Disrupting ACSS3-Mediated Propionate Metabolism”的高水平论文。研究揭示了肝细胞癌（HCC）不完全微波消融（incomplete Microwave Ablation,iMWA）术后复发的新型分子机制。

英文标题：HSP90α-USP7-DNMT1 Axis Drives Hepatocellular Carcinoma Recurrence After Microwave Ablation by Disrupting ACSS3-Mediated Propionate Metabolism

译文标题：HSP90α-USP7-DNMT1轴通过破坏ACSS3介导的丙酸代谢导致肝细胞癌微波消融后复发

发表时间：2026年6月26日

发表期刊：Molecular Therapy

影响因子：IF12/Q1

技术平台：RRBS等

作者单位：广州医科大学附属第二医院、中山大学孙逸仙医院

研究摘要

肝细胞癌（HCC）不完全微波消融（iMWA）通常会导致复发和转移。本研究发现iMWA后HCC残留病灶中的DNA甲基化机制异常激活。iMWA产生的亚致死热应激（sublethal heat stress）会激活热休克蛋白HSP90α，从而通过招募去泛素化酶USP7来稳定并上调DNA甲基转移酶DNMT1。HSP90α-USP7-DNMT1信号轴随后介导丙酸代谢关键酶ACSS3启动子区域高甲基化，沉默ACSS3表达，阻断丙酸向丙酰辅酶A转化；丙酰辅酶A减少可以显著增强脂肪酸β氧化（FAO）限速酶CPT1活性，进而增强FAO依赖性能量供应，最终促进HCC残留细胞的恶性进展与转移。基于上述机制，研究团队开发了基于脂质纳米颗粒（LNP）递送的CRISPR/dCas9靶向去甲基化系统，实现对ACSS3启动子的精准表观遗传再激活，有效预防iMWA后HCC的复发和转移，且与丙酸补充联合应用时效果更为显著。本研究结果揭示由DNMT1介导的“表观遗传-代谢级联”是促进iMWA后HCC复发的核心机制，强调了ACSS3靶向甲基化编辑的治疗潜力。

研究摘要

研究方法

（1）模型构建

²  iMWA模型：建立不完全微波消融的HCC细胞模型（亚致死热应激处理）及原位肝癌小鼠模型，模拟临床消融边缘残留肿瘤的微环境。

²  转移模型：通过尾静脉注射或原位移植评估残留HCC的肺转移和肝内转移能力。

（2）DNA甲基化+转录组分子机制探索及验证

²  DNA甲基化分析(RRBS):绘制PDOX模型对照组与iMWA术后24h残留肿瘤组织（n=3）的全基因组DNA甲基化图谱。

²  转录组测序(RNA-seq): 对shNC（对照组）、iMWA组和shDNMT1（敲低DNMT1）组肿瘤进行转录组测序，结合RRBS结果，筛选受DNMT1调控的核心下游基因。

²  MSP和BSP: 定性和定量检测ACSS3启动子甲基化。

（3）分子及细胞生物学方法

²  双荧光素酶报告基因实验：检测甲基化对转录活性的直接影响。

²  ChIP/Co-IP/IP-MS：免疫沉淀结合质谱鉴定DNMT1相互作用蛋白，发现HSP90α和USP7。

²  GST pull-down：体外验证HSP90α/DNMT1直接结合。

²  BiFC（双分子荧光互补）：验证DNMT1-HSP90α-USP7-互作。

²  CHX追踪实验与MG132抑制实验：评估蛋白半衰期和泛素-蛋白酶体降解通路。

²  Dot blot：检测全局5mC水平变化。

²  Western blot、RT-qPCR、IHC：常规蛋白和mRNA表达检测。

（4）代谢及功能实验

²  靶向代谢组学（UHPLC-MS/MS）：定量检测肿瘤组织中丙酸、丙酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、琥珀酰辅酶A、乙酰辅酶A水平。

²  脂质组学（UPLC-MS/MS）：检测甘油酯（DG、TG）等脂类变化，间接反映FAO活性。

（5）靶向干预

²  CRISPR/dCas9去甲基化系统构建:构建表达dCas9-TET1CD融合蛋白和靶向ACSS3启动子的sgRNA(sgACSS3)，以实现位点特异性去甲基化。

²  脂质纳米颗粒(LNP)制备:通过微流控技术，将dCas9-TET1CD-sgRNA质粒和/或丙酸钠(NaP)共包封在LNP中。为增强肝癌靶向性，在LNP表面偶联SP94多肽。

²  疗效评估:在CDOX和PDOX小鼠模型中，iMWA后给予不同LNP制剂处理，监测肿瘤体积、肺转移灶数量及面积、肿瘤组织Ki67增殖指数以评估疗效。

结果图形

（1）亚致死热应激通过诱导DNMT1表达重编程iMWA后HCC的DNA甲基化图谱

研究首先通过RRBS技术对iMWA后残留肿瘤与对照肿瘤进行全基因组DNA甲基化分析（图1A-E）。分析结果显示iMWA后残留肿瘤表现出显著的DNA高甲基化：CG甲基化率从对照组约40%左右上升到iMWA组的约47%。在基因启动子、CpG岛和genebody区域均观察到CG甲基化水平普遍升高。通过对患者样本和细胞模型进一步验证（图1F-K），发现iMWA后主要上调DNA甲基化转移酶DNMT1。体外亚致死热应激处理（47℃,15分钟）同样能诱导HCC细胞（Huh7,HCCLM3）的5mC水平和DNMT1蛋白水平升高（图1L-M），且DNMT1敲低可抑制该应激诱导的甲基化水平升高（图1N-P）。这一系列结论表明iMWA产生的亚致死热应激通过上调DNMT1以整体重编程残瘤细胞的DNA甲基化组。

图1：亚致死热应激通过诱导DNMT1表达重编程iMWA后HCC的DNA甲基化图谱

（2）HSP90α参与亚致死热应激诱导的DNMT1上调

为探究DNMT1上调机制，研究团队通过IP-MS揭示热休克蛋白HSP90的两个亚型HSP90α和HSP90β是DNMT1的主要互作成员（图2A-B）。进一步GST-pulldown实验证实其存在直接互作（图2C-D）。Co-IP和免疫荧光共定位验证显示，亚致死热应激特异性地增强DNMT1与诱导型HSP90α结合（图2E）。通过截短突变体实验，明了HSP90α的C端结构域(CTD)与DNMT1的复制点靶向序列(RFTS)结构域介导其结合（图2G-H）。功能实验表明，敲低HSP90α有效抑制亚致死热应激诱导的DNMT1蛋白水平升高（图2I-J）和5mC水平升高（图2K），且不影响DNMT1的mRNA水平（图2L），表明HSP90α通过转录后水平调控DNMT1稳定性。

图2：HSP90α与HCC细胞中DNMT1的直接结合介导亚致死热应激响应下DNMT1表达上调

（3）HSP90α通过增强USP7与DNMT1互作以抑制DNMT1的泛素-蛋白酶体降解

由于DNMT1 mRNA无变化而蛋白水平改变，研究团队聚焦于泛素-蛋白酶体通路。CHX追踪实验显示，HSP90α敲低后DNMT1蛋白半衰期显著缩短，并加速其降解（图3A-B）；而蛋白酶体抑制剂MG132可完全逆转HSP90α敲低引起的DNMT1下降（图3C），表明HSP90α通过抑制DNMT1的泛素-蛋白酶体降解来维持其稳定性。进一步的泛素化Co-IP实验证实，HSP90α敲低后DNMT1的泛素化水平显著增加（图3D）。

然而HSP90α本身不具有去泛素化酶活性。通过整合DNMT1和HSP90α的IP-MS数据，发现去泛素化酶USP7是DNMT1和HSP90α的共同互作蛋白（图3E）。随后的Co-IP（图3F）和BiFC（图3G）实验证实HSP90α、USP7和DNMT1三者之间存在互作网络。且亚致死热应激增强USP7与DNMT1的结合，而HSP90α敲低显著破坏USP7-DNMT1互作，并逆转了USP7对DNMT1的去泛素化作用（图3H-I）。上述分析结果揭示了HSP90α通过招募USP7对DNMT1进行去泛素化，从而促进DNMT1蛋白稳定。

图3：HSP90α通过增强USP7与DNMT1互作，抑制泛素化介导的DNMT1蛋白酶体降解

（4）亚致死热应激诱导的DNMT1上调促进iMWA后HCC复发和转移

为验证DNMT1上调对肿瘤进展的功能，研究构建多种小鼠模型（图4A、G、M）。在原位CDOX模型中，iMWA后，对照组（shNC）肿瘤体积较假手术组仅减少约30%，而DNMT1敲低组（shDNMT1）肿瘤体积则显著减少了80%以上（图4B-C），且shDNMT1组iMWA后肺转移灶数量和面积均显著减少，甚至个别组无转移，转移负荷显著降低（图4D-F）。在肿瘤块再移植实验和尾静脉注射肺转移模型中，也得到类似结果（图4H-L,N-P）。这些结果强有力地表明，iMWA后残瘤细胞的恶性进展（如复发、转移）与亚致死热应激诱导的DNMT1表达上调密切相关。

图4：亚致死热应激诱导的DNMT1上调促进iMWA后HCC进展

（5）丙酸代谢酶ACSS3在iMWA后HCC中被DNMT1介导的启动子高甲基化沉默

为寻找DNMT1下游的关键甲基化调控靶基因，研究者对三组HCCLM3肿瘤（shNC sham、shNC post-iMWA、shDNMT1 post-iMWA）进行了转录组测序(RNA-seq)。共鉴定出iMWA后表达下调、DNMT1敲低后表达上调的81个重叠基因（图5A）。KEGG通路分析显示，这些基因显著富集于“代谢通路”（图5B），其中ACSS3表达在DNMT1敲低后恢复最为显著（图5C）。ACSS3是一种催化丙酸向丙酰辅酶A转化的线粒体酶。BSP测序表明，iMWA后肿瘤中ACSS3启动子的CpG岛高甲基化，而DNMT1敲低能逆转高甲基化（图5E）。MSP、Western blot和RT-qPCR实验进一步证实，DNMT1过表达或亚致死热应激能诱导ACSS3启动子甲基化并抑制其表达（图5F-I）。荧光素酶报告基因实验也表明，ACSS3启动子甲基化能直接抑制其转录活性（图5J）。通过对TCGA数据库分析发现，HCC患者中ACSS3启动子的甲基化水平与其mRNA表达呈负相关，与DNMT1表达呈正相关，且ACSS3表达越低或DNMT1表达越高的患者预后更差（图5K-L）。上述研究结果揭示ACSS3是受DNMT1介导的启动子高甲基化抑制的直接靶基因。

图5：丙酸代谢酶ACSS3在iMWA后HCC中被DNMT1介导的启动子高甲基化表观遗传沉默

（6）DNMT1通过抑制ACSS3介导的丙酰辅酶A生成促进iMWA后HCC进展

iMWA后肿瘤中丙酸水平升高（底物堆积，反映利用受阻），DNMT1敲低后下降（图6B）。丙酰辅酶A、下游代谢物甲基丙二酰辅酶A和琥珀酰辅酶A在iMWA后显著降低，DNMT1敲低后恢复（图6C-E）。乙酰辅酶A在iMWA后升高，DNMT1敲低后下降（图6F）。

为进一步验证，研究团队通过在小鼠饮用水中补充丙酸盐(NaP)（图6G），结果显示丙酸盐补充能适度抑制肿瘤生长，而联用ACSS3过表达则效果更佳，但DNMT1过表达完全抵消了丙酸盐的抗肿瘤效果（图6H-L）。代谢物检测也证实，DNMT1过表达抑制了外源性丙酸盐向丙酰辅酶A转化（图6M-O）。这一系列结果证明，DNMT1通过抑制ACSS3活性、阻断丙酸代谢通路、从而促进HCC进展。

图6：DNMT1通过破坏ACSS3依赖性丙酸代谢促进iMWA后HCC进展

（7）DNMT1抑制ACSS3生成的丙酰辅酶A，增强iMWA后HCC细胞的脂肪酸β氧化(FAO)

丙酰辅酶A及其下游代谢物是CPT1（脂肪酸β氧化限速酶）的天然抑制剂（图7A）。基于上述乙酰辅酶A在iMWA后升高、DNMT1敲低后下降的发现，研究者推测DNMT1通过消除丙酰辅酶A对CPT1的抑制而异常激活FAO。

脂质组学分析发现，iMWA后肿瘤中甘油酯（DGs、TGs）显著减少，表明脂质分解增强（图7B-C）。敲低DNMT1则逆转了这种改变。从肿瘤中分离HCC细胞直接检测FAO活性，结果显示iMWA后肿瘤细胞中的FAOBlue荧光强度（FAO活性）、ATP-Red荧光强度（ATP水平）以及CPT1酶活性均显著升高，而DNMT1敲低则能降低这些指标（图7D-E）。Seahorse分析进一步确认，以棕榈酸为底物时，ACSS3过表达显著降低HCC细胞的OCR（耗氧率），包括基础呼吸、ATP产能和最大呼吸能力；而DNMT1过表达则逆转这一效应（图7F-I）。ETOM（CPT1抑制剂）可阻断这些变化，确证FAO依赖性。这些结果清晰描绘了“DNMT1→ACSS3沉默→丙酰辅酶A减少→CPT1抑制解除→FAO增强→ATP供应增加”的代谢重编程路径。

图7：DNMT1通过抑制ACSS3依赖性丙酸代谢增强iMWA后HCC细胞的FAO

（8）LNP递送的CRISPR/dCas9系统通过ACSS3启动子的靶向去甲基化抑制iMWA后HCC进展

基于上述发现，研究团队通过构建dCas9-TET1CD-sgACSS3质粒，开发了一种基于脂质纳米颗粒（LNP）递送的CRISPR/dCas9靶向去甲基化系统（图8A），该系统可以特异性递送至肝癌组织，实现ACSS3启动子的靶向去甲基化，恢复其表达，同时提供反应底物丙酸盐。在体内疗效评估中（图8F），该联合处理组（G5组）极其显著地抑制iMWA后的肿瘤生长和肺转移（图8G-K）。免疫组化染色证实，ACSS3的表达得到有效恢复，而Ki67增殖指数显著降低（图8L-N）。代谢物分析进一步表明，该疗法有效恢复肿瘤的丙酰辅酶A水平（图8O-P），并显著降低FAO活性和ATP生成（图8Q-R）。毒理学评估显示该LNP系统生物安全性良好。上述研究结果再次验证ACSS3是关键靶点，并提示精准表观遗传编辑技术的巨大临床应用潜力。

图8：原位HCCLM3小鼠模型中iMWA后ACSS3靶向去甲基化干预的治疗效果

结论和启示

本研究通过DNA甲基化测序（RRBS）及一系列功能实验系统阐明了“HSP90α-USP7-DNMT1轴”如何通过表观遗传学机制介导HCC微波消融术后的复发与转移：iMWA产生的亚致死热应激激活该轴，导致DNMT1稳定性和表达上升，进而引发残瘤细胞的整体DNA高甲基化，其中关键代谢酶ACSS3被高甲基化而沉默。ACSS3缺失抑制了丙酸代谢，消除了对FAO的抑制，导致癌细胞转向依赖FAO供能以供其快速生长和转移。最后，作者开发了一种靶向ACSS3启动子的CRISPR/dCas9表观遗传编辑联合底物补充的精准治疗策略，在动物模型中疗效显著。

RRBS在本研究中的重要作用

²  绘制DNA甲基化全景图谱：单碱基分辨率、无偏倚检测全基因组甲基化状态，揭示由特定应激（如iMWA）引发的表观遗传全景变化。

²  发现关键调控因子：通过比较不同处理组（如sham vs. iMWA）的甲基化图谱，鉴定出在疾病进程中的DMRs，为寻找潜在的、受甲基化调控的关键基因（如ACSS3）提供了关键靶点。

²  指导机制深入研究：引导研究者探索上游何种信号（如HSP90α-USP7-DNMT1轴）引发这一系列甲基化变化，以及下游哪些基因的沉默导致功能改变（如代谢重编程）。

参考文献：

Chen Y, …Huang W. HSP90α-USP7-DNMT1 Axis Drives Hepatocellular Carcinoma Recurrence After Microwave Ablation by Disrupting ACSS3-Mediated Propionate Metabolism. Mol Ther. 2026 Jun 27. doi: 10.1016/j.ymthe.2026.06.035.