南科大团队DNA去甲基化招募转录抑制因子调控果实风味酯合成

2026年7月1日，南方科技大学郎曌博教授团队和杜嘉木教授团队合作，在《Nature Communications》（Q1/IF18.1）期刊发表题为“DNA hypomethylation enables the transcriptional repressor SlSPL-CNR to control fruit flavor ester biosynthesis”的高水平科研成果。研究通过整合全基因组甲基化测序（WGBS）、体外DAP-seq/ampDAP-seq结合图谱、体内染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）等多组学研究揭示了DNA甲基化动态变化通过调控转录因子SlSPL-CNR的DNA结合力，进而影响番茄果实风味酯合成的分子机制。

英文标题：DNA hypomethylation enables the transcriptional repressor SlSPL-CNR to control fruit flavor ester biosynthesis

译文标题：DNA去甲基化招募转录抑制因子SlSPL-CNR调控果实风味酯合成

发表时间：2026年7月1日

发表期刊：Nature Communications

影响因子：IF18.1/Q1

技术平台：WGBS、ChIP-seq、DAP-seq等

作者单位：南方科技大学

DOI：10.1038/s41467-026-75181-8

传统研究认为DNA去甲基化通常激活基因表达，但本研究揭示了番茄果实成熟过程中一个新颖的、出人意料的表观遗传调控机制。在番茄果实成熟时，由去甲基化酶SlDML2介导的启动子区域DNA去甲基化，反而会招募一种对甲基化敏感的转录抑制因子SlSPL-CNR。SlSPL-CNR结合到去甲基化的目标基因（如风味相关基因SlAAT1）启动子上，抑制其过表达，从而调控果实风味物质（酯类代谢物）的生物合成。

结构分析揭示，胞嘧啶甲基化与SlSPL-CNR的SBP结构域中Gln94残基产生空间位阻，解释了其甲基化敏感性。CRISPR敲除SlSPL-CNR可解除对SlAAT1的抑制并增加酯类积累，证实其抑制功能。且这种甲基化敏感结合特性在水稻、玉米和番茄的SBP结构域蛋白中高度保守。本研究利用WGBS、DAP-seq/ampDAP-seq、ChIP-seq、X射线晶体结构解析及CRISPR遗传验证等多种技术手段，从分子、细胞和个体水平完整揭示了DNA低甲基化促进抑制因子招募的分子机制，建立了将表观遗传动态与植物代谢调控相联系的调控逻辑。

研究方法

（1）植物材料：番茄Ailsa Craig (AC) 野生型和基于CRISPR/Cas9技术构建的slcnr敲除突变体和pCNR::gCNR-3xFLAG等转基因株系。

（2）体外转录因子结合分析（DAP-seq & ampDAP-seq）：

DAP-seq：TF在天然甲基化修饰DNA上的结合谱。

ampDAP-seq：TF在没有甲基化修饰DNA上的结合谱。

比较分析：比较DAP-seq和ampDAP-seq的peaks信号，鉴定出SlSPL-CNR在“甲基化”和“未甲基化”条件下的结合差异。

（3）全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）：不同发育阶段（如绿果、破色期、红果）番茄果实DNA，以单碱基分辨率绘制全基因组DNA甲基化图谱，鉴定DNA甲基化动态变化及与TF结合关联分析。

（4）体内染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）：绿果期（30 dpa）和破色期（38 dpa）果实组织，通过抗FLAG抗体富集SlSPL-CNR结合的染色质片段并测序，获取其在体内真实的结合位点图谱。

（5）电泳迁移率变动分析（EMSA）：定性/定量评估甲基化对结合亲和力的影响。

（6）等温滴定量热法（ITC）：从热力学角度定量评估甲基化对结合亲和力的影响。

（7）X射线晶体学：从原子层面揭示蛋白识别特定DNA序列（GTACGG）和排斥甲基化胞嘧啶的分子机制（空间位阻）。

（8）转录与代谢水平分析：

RT-qPCR：检测SlAAT1等目标基因在不同番茄品系（WT, slcnr突变体）和发育阶段的转录水平。

双荧光素酶报告基因实验：在烟草叶片中瞬时共表达SlSPL-CNR和SlAAT1启动子驱动的报告基因，验证SlSPL-CNR对SlAAT1的转录调控作用（抑制）。

HS-SPME/GC-MS：分析slcnr突变体和野生型番茄果实在破色期的挥发性有机化合物（VOCs）谱，特别是酯类物质的差异。

结果图形

（1）SlSPL-CNR在体外偏好结合低甲基化基因组区域

为系统解析SlSPL-CNR的DNA甲基化结合特性，研究团队结合体外DAP-seq（保留基因组天然甲基化）与ampDAP-seq（PCR扩增去除甲基化）技术，在全基因组水平获取了两种条件下SlSPL-CNR的结合图谱，并同步进行WGBS生成成熟期果实的全基因组甲基化图谱（WTRed）。两种方法均高度可重复，分别鉴定到103,923个和111,371个结合peaks，这些peaks在基因区域及转录起始/终止位点附近显著富集（图1a-c）。

通过比较并根据相对信号强度将peaks分为三类：26,317个为DAP增强型peaks（偏好未甲基化），58,741个为稳定型peaks（不受甲基化影响），128,268个为ampDAP增强型peaks（甲基化抑制型）。其中ampDAP增强型peaks数量远多于DAP增强型peaks，表明SlSPL-CNR在DNA去甲基化后表现出更强结合力（图2a）。进一步分析发现，ampDAP增强型peaks区域的平均甲基化水平显著高于稳定型peaks区域（图2c），且结合信号强度与甲基化水平呈显著负相关（图2d）。上述结果表明，SlSPL-CNR在体外显著偏好于结合低甲基化或未甲基化DNA区域。

图1：SlSPL-CNR的DAP-seq和ampDAP-seq结合谱分析

图2：胞嘧啶甲基化在体外调控SlSPL-CNR结合

（2）GTAC-box中胞嘧啶甲基化降低SlSPL-CNR的DNA结合亲和力

为验证5-mC对SlSPL-CNR直接结合的抑制效应，研究团队设计了15 bp DNA探针（GTAC-box1），包含未甲基化、半甲基化（仅正义链5-mC）和全甲基化（双链5-mC）的GTAC基序序列（图3a）。EMSA结果显示，全长SlSPL-CNR及其SBP结构域（46–136位氨基酸）均能有效结合未甲基化探针，但无法结合半甲基化或全甲基化探针（图3b），证实GTAC-box中的5-mC可降低SlSPL-CNR的DNA结合亲和力。

为进一步定量评估结合敏感性，研究团队进行了等温滴定量热法（ITC）分析。全长SlSPL-CNR及其SBP结构域对未甲基化探针表现出最强结合亲和力，而半甲基化探针显著降低其结合亲和力（图3c）。EMSA和ITC结果共同表明，GTAC基序内的DNA甲基化显著抑制SlSPL-CNR及其SBP结构域对靶DNA序列的结合亲和力。

图3：SlSPL-CNR对不同甲基化状态GTAC基序的DNA结合特异性

（3）SlSPL-CNR SBP结构域与未甲基化DNA复合体的晶体结构

为揭示SlSPL-CNR识别未甲基化GTACGG基序的分子机制，研究团队解析了SBP结构域（aa46-130）与11 bp未甲基化DNA复合体的高分辨率晶体结构。结构分析发现，蛋白的关键氨基酸谷氨酰胺94（Gln94，Q94）通过氢键与DNA链中“GTACGG”基序上的第七位胞嘧啶（C7）发生特异性互作（图4k）。然而，当研究人员模拟将C7替换为甲基化胞嘧啶（me-C7）时，发现甲基基团与Gln94的主链羰基产生严重的空间位阻（图4n）。这种物理上的碰撞直接抑制蛋白与DNA的正确结合，从而解释了SlSPL-CNR为何无法结合甲基化DNA。这一结构模型为SlSPL-CNR的“甲基化敏感性”提供了原子水平证据。

图4：SlSPL-CNR SBP-DNA复合体的晶体结构

（4）SlSPL-CNR体内与体外结合谱的比较分析

为比较体内外结合特征，对pCNR::gCNR-3xFLAG转基破色期（Br）果实进行ChIP-seq（CNR-BrChIP）分析SlSPL-CNR在体内的真实结合位点，共鉴定出3,413个peaks，其中3,027个（约90%）与CNR-DAP重叠（图5c）。基序分析同样富集“GTACGG”，与体外一致。通过整合染色质可及性数据（DNase I超敏感位点，DHS）和组蛋白修饰数据（H3K4me3/H3K27ac），研究团队发现体外特异性peaks显著富集在染色质关闭区域（DHS信号低）和转录沉默区域（H3K4me3/H3K27ac低）（图5c, f）。表明SlSPL-CNR体内结合受到DNA甲基化和染色质可及性/组蛋白修饰的多层表观调控。

图5：SlSPL-CNR DAP-seq与ChIP-seq peaks的比较分析

（5）成熟诱导的DNA低甲基化部分重塑SlSPL-CNR在体内的结合谱

番茄果实成熟伴随着整体DNA去甲基化。研究团队比较了绿果期（Green）和破色期（Br）的ChIP-seq数据，发现从绿果到破色期，SlSPL-CNR的结合信号整体增强。重点分析了3,080个含有“GTACGG”基序的结合位点，并鉴定出190个在成熟过程中CG第四个位置发生特异性去甲基化（hypo-C4）的位点。通过基因集富集分析（图6b），发现这些发生去甲基化的位点显著富集在SlSPL-CNR结合信号增强的区域（ES=0.35）。上述结果直接证明果实成熟过程中由SlDML2介导的DNA去甲基化，是导致SlSPL-CNR在体内结合增强的直接原因。

图6：成熟相关DNA去甲基化增强SlSPL-CNR与SlAAT1的结合以调控风味酯类合成

（6）DNA低甲基化介导的SlSPL-CNR与SlAAT1结合调控风味酯类合成

关键靶基因SlAAT1（醇酰基转移酶1）是番茄风味酯类合成的核心酶。研究发现，SlAAT1启动子在成熟过程中发生显著的DNA去甲基化，增强了SlSPL-CNR与启动子上两个GTAC基序的结合（图6d）。EMSA实验证实SlSPL-CNR对SlAAT1启动子结合具有“甲基化敏感性”（图6e）。进一步研究团队通过双荧光素酶报告基因实验（图6f）和CRISPR敲除突变体（slcnr）的RT-qPCR分析（图6g）确认SlSPL-CNR是一个转录抑制因子，直接与SlAAT1启动子结合并抑制其表达。当敲除SlSPL-CNR后，SlAAT1表达显著升高，同时通过GC-MS分析发现，突变体果实中多种风味酯类的含量也显著增加（图6h-i）。这一系列实验揭示了从“成熟去甲基化 → 促进抑制因子结合 → 抑制酯合成酶表达 → 均衡酯类积累”的完整调控通路。

（7）SBP结构域转录因子家族中保守的DNA甲基化敏感性

最后，研究团队探究了这一机制的广泛性。通过系统发育分析和序列比对（图7a），研究团队发现SlSPL-CNR用于识别甲基化敏感性的关键氨基酸残基Gln94/95在多种作物的SPL蛋白中高度保守。通过对番茄、水稻（OsSPL14）和玉米（ZmSPL15）共12种不同的SBP结构域的EMSA实验，结果一致表明所有这些SBP蛋白都表现出与SlSPL-CNR相似的甲基化敏感性：能结合未甲基化DNA，但对半甲基化或全甲基化DNA的结合力显著降低（图7b）。上述分析表明DNA甲基化对SPL转录因子结合是在单子叶和双子叶植物中广泛保守的古老调控机制，对理解多种作物的农艺性状具有重要意义。

图7：番茄、水稻和玉米SBP结构域中保守的DNA甲基化敏感性

结论和启示

本研究在植物中系统证明，一个对甲基化敏感的转录抑制因子SlSPL-CNR，通过识别果实成熟过程中的DNA去甲基化信号，以动态调控风味物质合成，从而揭示了表观遗传与代谢调控之间的直接联系。结论明确指出，DNA甲基化不仅是“沉默”基因的开关，也是“招募”抑制因子的信号。

参考文献：

Zeng Z, Ma Y, He H, Li L, Peng Y, Hou Y, Chai S, Wang P, Duan CG, Zhu JK, Du J, Lang Z. DNA hypomethylation enables the transcriptional repressor SlSPL-CNR to control fruit flavor ester biosynthesis. Nat Commun. 2026 Jul 1. doi: 10.1038/s41467-026-75181-8.