溶瘤病毒通过骨肉瘤中的非结构蛋白破坏超增强子介导的致癌转录

近日，中山大学附属第一医院骨肿瘤科医师刘伟海助理研究员/沈靖南教授与中山大学中山医学院蔡静副教授团队合作，在Nature子刊《Nature Communications》发表题为“Alphavirus M1 disrupts super-enhancer-driven oncogenic transcription via non-structural protein NSP2 in osteosarcoma”的高水平科研成果。研究通过ChIP-seq、RNA-seq等多组学技术，将溶瘤病毒疗法的作用机制与超级增强子转录调控直接关联，系统揭示一个全新的不依赖ER应激的溶瘤机制，并为骨肉瘤溶瘤病毒治疗的生物标志物（RPB1）筛选提供了新思路。

英文标题：Alphavirus M1 disrupts super-enhancer-driven oncogenic transcription via non-structural protein NSP2 in osteosarcoma

译文标题：溶瘤病毒M1通过骨肉瘤中的非结构蛋白NSP2破坏超增强子介导的致癌转录

发表时间：2026年7月1日

发表期刊：Nature Communications

影响因子：IF18.1/Q1

技术平台：ChIP-seq、RNA-seq

作者单位：中山大学附属第一医院、中山大学中山医学院、中山大学孙逸仙纪念医院

DOI：10.1038/s41467-026-75013-9

研究摘要

溶瘤病毒疗法已在多种癌症中展现出治疗潜力，但其在骨肉瘤中的应用探索有限。本研究首先揭示了M1病毒对骨肉瘤具有溶瘤活性。骨肉瘤细胞对M1病毒感染表现出高度敏感性，且其抗肿瘤作用并不仅仅依赖于经典的内质网（ER）应激诱导的细胞凋亡通路。蛋白质组学和ChIP-seq分析显示，DNA指导的RNA聚合酶II亚基RPB1参与致癌性超级增强子的活性，并作为M1病毒介导调控的直接靶点。溶瘤效应与超级增强子区域内对RPB1的转录依赖性呈正相关。

具体而言，病毒的非结构蛋白NSP2通过特异性招募CUL2-RBX1-ELOC E3泛素连接酶复合体以破坏超级增强子活性，从而诱导RPB1发生K63连接泛素化及蛋白酶体降解。RPB1降解特异性破坏骨肉瘤细胞中驱动癌基因表达的“超级增强子（Super-Enhancer, SE）”的致癌基因转录活性，进而高效抑制肿瘤生长和转移。本研究揭示了M1病毒在骨肉瘤中一种此前未被认识的机制，支持了M1在此适应症中的进一步临床前评估，并确定了RPB1可作为病毒疗法反应的候选生物标志物。

图形摘要：M1病毒通过RPB1降解及超级增强子抑制以阻碍骨肉瘤进展的机制示意图

M1病毒感染骨肉瘤细胞后，其非结构蛋白NSP2结合宿主RPB1并招募CUL2-RBX1-ELOC E3泛素连接酶复合体，催化RPB1的K63泛素化修饰，标记其经蛋白酶体降解；RPB1缺失导致RNA聚合酶II在超级增强子区域的转录延伸/启动功能受损，最终抑制骨肉瘤致癌基因转录及肿瘤恶性进展。

研究方法

（1）细胞与病毒：人骨肉瘤细胞系（U2-OS, SJSA-1等）及原代细胞系、M1病毒及其重组衍生物（M1-GFP和M1-iRFP）。

（2）动物实验：

²  模型建立：SJSA-1细胞（人源，免疫缺陷BALB/c裸鼠）和K7M2细胞（同源免疫健全BALB/c小鼠）中建立胫骨原位骨肉瘤异种移植模型。

²  给药方案：尾静脉注射表达iRFP的M1病毒，活体成像系统（IVIS）追踪病毒分布，并通过RT-qPCR、病毒滴定、免疫组化检测病毒在肿瘤及各器官的分布。

²  疗效评估：对荷瘤小鼠进行连续尾静脉注射M1病毒，监测肿瘤体积、体重、肺部转移结节数量。通过H&E染色评估器官毒性。

（3）细胞功能实验：MTT法检测细胞活力，克隆形成实验评估增殖，Transwell小室实验评估迁移和侵袭力，透射电子显微镜观察内质网肿胀和细胞死亡。

（4）多组学分析

²  转录组学（RNA-seq）：提取M1病毒感染或NSP2过表达的骨肉瘤细胞RNA进行转录组测序，GSEA分析基因集富集情况。

²  表观基因组学（ChIP-seq）：H3K27ac（组蛋白修饰，标记活跃的增强子和超级增强子）和RPB1（RNA聚合酶II最大亚基）的抗体进行染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq），分析M1病毒感染前后超级增强子变化。

²  蛋白质组学（TMT LC-MS/MS）：TMT标记结合液相色谱-串联质谱技术，定量分析M1病毒感染后骨肉瘤细胞中蛋白质水平的变化，以鉴定受影响的信号通路和关键蛋白。

²  免疫共沉淀-质谱（IP-MS）：抗RPB1抗体富集M1感染U2-OS细胞裂解液中RPB1互作蛋白复合体，LC-MS/MS鉴定，重点识别病毒非结构蛋白NSP1、NSP2等与RPB1的结合。

（5）分子机制验证实验：蛋白降解通路鉴定、泛素链类型鉴定、E3连接酶鉴定、NSP2功能验证、基因敲低与过表达

（6）临床样本分析：对116例骨肉瘤患者的石蜡切片进行RPB1免疫组化染色，分析其表达水平与总生存期和肺转移无进展生存期的相关性。

结果图形

（1）M1病毒可高效感染并抑制骨肉瘤细胞恶性表型

研究首先通过细胞实验初步验证了M1病毒对骨肉瘤的抗肿瘤活性。研究团队使用M1-GFP感染U2-OS与SJSA-1细胞，发现病毒在24 h内即可实现高效感染与快速复制（图1a）。功能实验显示，M1感染显著抑制骨肉瘤细胞增殖（图1b）、克隆形成（图1c）以及迁移与侵袭（图1d）。在11种骨肉瘤细胞系（含3种原代细胞）中，M1表现出广泛的抗增殖效应（图1e）。此外通过对比先前发表的包含70种非骨肉瘤癌细胞系的泛癌数据，研究团队发现骨肉瘤细胞对M1病毒介导的抑制作用表现出高度敏感（图1f-g）。该结果为后续机制探索奠定表型基础。

图1：M1病毒在骨肉瘤细胞中的感染、复制及抗肿瘤效应

（2）M1病毒在体内的生物分布与抗肿瘤效应

利用M1-iRFP及活体成像系统，研究团队发现经尾静脉注射的M1病毒在BALB/c裸鼠体内选择性聚集于原位骨肉瘤病灶，而正常器官（脑、心、肝、脾、肺、肾、结肠、骨骼肌、骨）未见明显病毒信号（图2a-b）。每日给药持续14天后，M1治疗组肿瘤体积生长被显著抑制（图2d），终末瘤重显著降低（图2f）。在肺转移评估中，M1组6只小鼠肺部未见转移结节，而对照组3/6出现肺转移（图2g-h）。同时在免疫健全小鼠K7M2同源模型中，M1同样表现出相似的肿瘤选择性分布与抗肺转移效应。所有器官H&E染色未发现明显病理损伤（图2i），体质量无显著变化（图2e），提示M1病毒在体内具有肿瘤靶向性和安全性，并能有效抑制骨肉瘤的进展和转移。

图2：M1病毒的体内生物分布及其抗肿瘤作用

（3）M1在骨肉瘤中的效应不唯一依赖于内质网应激

以往研究认为M1病毒主要通过内质网(ER)应激诱导凋亡通路发挥作用，但在骨肉瘤中情况有所不同。研究团队透射电镜观察到M1感染后U2-OS与SJSA-1出现ER扩张及细胞核固缩（图3a-b），但ER应激标志物BiP与CHOP的蛋白水平在感染后并未显著上调。进一步对11种骨肉瘤细胞系的ER扩张程度与M1细胞毒性进行相关性分析，结果显示两者无显著相关（图3c-e）。此外，M1的感染与复制效率与细胞敏感性也不相关。这些结果表明，M1在骨肉瘤中的溶瘤效应不能仅归因于经典的ER应激-凋亡通路，提示存在其他主导机制。

图3：M1病毒诱导的骨肉瘤细胞内质网应激及凋亡反应分析

（4）M1病毒特异性破坏骨肉瘤中超级增强子活性

为寻找M1病毒新的作用机制，研究者通过RNA-seq发现，M1感染早期就有大量基因表达显著下调，这些基因富集在肿瘤相关通路中（图4a-b）。这种大规模的特异性基因沉默是如何发生的？为此，研究团队以H3K27ac修饰作为转录活性增强子标记，对M1感染前后的SJSA-1细胞进行ChIP-seq分析。

结果显示，M1下调基因在其启动子/增强子区域具有异常高丰度的H3K27ac信号，提示这些基因受超级增强子调控（图4c）。GSEA富集分析显示M1感染后超级增强子相关基因整体表达显著下调（图4d-e），且与肿瘤信号通路和癌基因相关的超级增强子关联的驱动基因（如FASN、SPARC、FGF1、ERG等）的表达被特异性抑制（图4f-i）。

此外，M1病毒感染后，全基因组范围内超级增强子（SE）区域的H3K27ac信号显著下降，大量SE元件丢失超级增强子分子特征（图4g-h），基因组浏览器可视化清晰展示了FASN、SPARC等癌基因相关SE区域H3K27ac信号的丢失（图4i）。

图4：M1病毒靶向抑制骨肉瘤细胞中肿瘤相关的超级增强子活性

（5）RPB1下调与M1诱导的超级增强子抑制相关

研究进一步揭示了RPB1蛋白是超级增强子被破坏的“靶点”。研究团队通过TMT蛋白质组学定量分析，研究者发现RNA聚合酶II（RNAPII）的最大催化亚基RPB1（由POLR2A基因编码）在M1感染后显著下调（图5a）。随后利用抗RPB1抗体进行ChIP-seq，发现RPB1信号在SE区域与H3K27ac信号呈正相关（图5b）。以RPB1信号运行ROSE算法，鉴定出骨肉瘤中RPB1相关超级增强子（RPB1-SE）（图5c），这些RPB1-SE区域具有更高的H3K27ac信号，且其关联基因表达更高（图5d-e）。RPB1高表达与116例骨肉瘤患者的总生存期(OS)和肺转移无生存期(LMFS) 缩短显著相关（图5f），提示其是预后不良的标志物。

在细胞功能实验中，敲低RPB1能抑制骨肉瘤细胞增殖（图5g），而过表达RPB1则可拮抗M1的细胞毒性（图5h）。同时，骨肉瘤细胞相比其他癌细胞表达更高水平的RPB1蛋白（图5i），且POLR2A表达高的细胞系对M1病毒更敏感（图5j）。表明RPB1是M1病毒发挥溶瘤作用的关键靶点，并可能是疗效预测的生物标志物。

图5：M1病毒感染抑制转录复合体中与超级增强子区域结合的RPB1蛋白

（6）M1通过K63连接泛素化诱导RPB1蛋白经蛋白酶体降解

研究团队聚焦M1病毒降低RPB1蛋白水平的具体分子机制。研究发现，M1病毒感染并不影响POLR2A的mRNA水平（图6a），而是通过泛素-蛋白酶体通路降解RPB1蛋白（图6b）。免疫沉淀（IP）实验证实，M1感染后RPB1的泛素化水平显著增强（图6c），且泛素链类型为K63连接（图6d）。

通过使用neddylation抑制剂MLN4924，发现其能完全阻断RPB1泛素化，表明Cullin-RING E3连接酶（CRL）家族负责泛素化（图6e）。随后，通过系统性敲低实验，研究团队精确鉴定出介导该过程的是CUL2-RBX1-ELOC（Elongin C）复合体（图6f-6i）。Co-IP实验也证实RPB1与CUL2、RBX1、ELOC之间存在直接互作（图6j）。

图6：M1病毒通过CUL2-RBX1-ELOCE3连接酶诱导RPB1蛋白泛素化及降解

（7）非结构蛋白NSP2在骨肉瘤细胞中招募CRL2复合体介导RPB1降解

抗RPB1免疫沉淀+质谱（IP-MS）分析显示，M1感染的U2-OS细胞中RPB1与病毒NSP1、NSP2均存在互作（图7a）。单独过表达NSP1–NSP4，仅NSP2可降低RPB1蛋白水平（图7b）。Co-IP验证NSP2与RPB1直接结合（图7c），且NSP2表达增强RPB1泛素化（图7d）。在NSP2过表达细胞中分别敲低CUL2、RBX1或ELOC，RPB1降解被有效阻断（图7e），证实NSP2介导的降解仍依赖CUL2-RBX1-ELOC复合体。Co-IP显示NSP2可同时结合CUL2、RBX1与ELOC（图7f）。RNA-seq显示NSP2过表达选择性下调超级增强子相关基因转录（图 7g）。细胞功能实验也证实NSP2抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移与侵袭（图7h-i）。

图7：M1病毒非结构蛋白NSP2通过诱导RPB1泛素化介导抗骨肉瘤活性

结论和启示

研究通过H3K27ac ChIP-seq和RPB1 ChIP-seq等分析揭示M1溶瘤病毒在骨肉瘤中主要通过其非结构蛋白NSP2，介导RPB1蛋白的K63泛素化降解，从而破坏驱动癌基因表达的超级增强子活性，实现对肿瘤的高效抑制。进一步鉴定出RPB1是M1病毒的关键作用靶点，其表达水平可作为预测M1病毒疗效的候选生物标志物。并证实靶向超级增强子的表观遗传调控是溶瘤病毒疗法的一种全新作用模式，为骨肉瘤和其他癌症的治疗提供了新思路。

ChIP-seq在本研究中的重要作用

²  鉴定功能性转录调控元件：通过H3K27ac ChIP-seq建立骨肉瘤全基因组增强子/超级增强子图谱，明确M1对SE的靶向抑制而非全基因组效应（图4c-i）。

²  从“组蛋白修饰”到“转录因子/聚合酶占据”：RPB1 ChIP-seq不仅证实RPB1在SE区域富集，更通过ROSE算法鉴定出以RPB1为靶点的超级增强子（RPB1-SE）（图5b-e）。

²  动态检测靶标变化：M1感染前后H3K27ac与RPB1的ChIP-seq平行比较，从全基因组分辨率展示SE结构完整性及RPB1占据的同步降解，将“病毒→宿主因子→表观调控”的因果可视化。

²  为临床标志物筛选提供证据：ChIP-seq发现RPB1在SE的功能依赖性，推动后续临床队列IHC验证（图5f），实现“表观组学发现→蛋白质验证→临床队列预后分析→治疗敏感性预测”全流程转化。

参考文献：

Zhang J, Yin L, Han Q, Li Y, Wu F, Huang S, Zhang J, Fu Y, Huang G, Xu Y, Yin H, Liang J, Zhu W, Lin Y, Yan G, Yin J, Shen J, Cai J, Liu W. Alphavirus M1 disrupts super-enhancer-driven oncogenic transcription via non-structural protein NSP2 in osteosarcoma. Nat Commun. 2026 Jul 1. doi: 10.1038/s41467-026-75013-9.