化妆品与皮肤科学 | 侧柏叶提取物、腺苷和米诺地尔对毛乳头细胞功能及线粒体调控作用的体外比较研究

许耀豪，刘嘉烁，张得香，何敬愉，刘忠^＊.侧柏叶提取物、腺苷和米诺地尔对毛乳头细胞功能及线粒体调控作用的体外比较研究[J].中国食品药品监管.2026.07（270）：158-167.

许耀豪

暨南大学生命科学技术学院

广州环亚化妆品科技股份有限公司

XU Yao-hao

College of Life Science and Technology,Jinan University

Guangzhou Uniasia Cosmetics Technology Co., Ltd.

刘嘉烁

广州环亚化妆品科技股份有限公司

LIU Jia-shuo

Guangzhou Uniasia Cosmetics Technology Co., Ltd.

张得香

广州环亚化妆品科技股份有限公司

ZHANG De-xiang

Guangzhou Uniasia Cosmetics Technology Co., Ltd.

何敬愉

广州环亚化妆品科技股份有限公司

HE Jing-yu

Guangzhou Uniasia Cosmetics Technology Co., Ltd.

刘忠^＊

暨南大学生命科学技术学院

LIU Zhong*

College of Life Science and Technology,Jinan University

目的：探讨侧柏叶提取物、腺苷和米诺地尔对毛乳头细胞功能及线粒体的调控作用，为基于线粒体功能的防脱策略提供实验依据。方法：采用CCK-8 试剂盒检测侧柏叶提取物、腺苷和米诺地尔3种防脱活性成分对毛乳头细胞活力的影响，筛选出最佳活性浓度；利用JC-1 探针分析线粒体膜电位变化；通过实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测毛发生长相关基因表达；基于三维球体培养和过氧化氢损伤模型，评估3 种活性成分在生理及损伤状态下的作用。结果：0.10% 侧柏叶提取物可显著提升毛乳头细胞活力和线粒体膜电位，并上调Wnt/β-catenin 的相关基因表达；腺苷和米诺地尔在活性浓度下也能增强毛乳头细胞活力，但对线粒体膜电位提升作用有限。三维球体培养显示，0.10%侧柏叶提取物可维持毛乳头球体致密度，并显著改善氧化损伤后毛乳头细胞活力。结论：侧柏叶提取物在毛乳头细胞线粒体功能保护及代谢维持中表现出显著优势，提示其具有特殊的防脱机制，为其防脱功效提供了新的机制解释。

Objective: This study aims to investigate the effects of Platycladus orientalis leaf extract (POLE), adenosine, and minoxidil on dermal papilla cell (DPC) function and mitochondrial regulation, providing experimental evidence for mitochondrial function-based anti-hair loss strategies. Methods: The effects of three anti-hair loss active ingredients (POLE, adenosine, and minoxidil) on DPC viability were evaluated using the cell counting kit-8 assay to determine optimal concentrations. Changes in mitochondrial membrane potential (MMP) were analyzed using the JC-1 probe. The expression of hair growth-related genes was assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). The effects of the three ingredients under physiological and oxidative stress conditions were evaluated using 3D spheroid culture and a hydrogen peroxide (H₂O₂)-induced injury model. Results: POLE at 0.10% significantly enhanced DPC viability and mitochondrial membrane potential, and upregulated the expression of Wnt/β-catenin-related genes. Although adenosine and minoxidil also increased DPC viability at their respective active concentrations, their effects on mitochondrial membrane potential were limited. 3D spheroid culture demonstrated that 0.10% POLE maintained DPC spheroid compactness and significantly improved cell viability following oxidative injury. Conclusion: POLE exhibits significant advantages in protecting mitochondrial function and maintaining metabolism in DPCs. This suggests a unique antihair loss mechanism, providing a new mechanistic explanation for its efficacy in preventing hair loss.

侧柏叶提取物；毛乳头细胞；线粒体膜电位；代谢；防脱

Platycladus orientalis leaf extract; dermal papilla cells; mitochondrial membrane potential; metabolism; anti-hair loss

毛乳头细胞（dermal papilla cells, DPCs）位于毛囊真皮乳头，是毛囊微环境中的关键信号调控中心，其数量和功能状态直接决定毛囊的生长和退化^[1-2]。毛乳头细胞作为毛囊发育的结构核心，会通过分泌多种生长因子和信号分子来调控毛囊上皮细胞的命运，从而影响毛发生长与脱发过程。在毛囊发育和生长周期中，毛乳头细胞通过分泌多种生长因子[ 如胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子7（fibroblast growth factor 7，FGF-7）等] 以及信号分子[ 包括Wnt/β-catenin 信号通路（Wnt/β-catenin signaling pathway，Wnt/β-catenin）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等途径]，调控毛母细胞的增殖和分化，从而决定毛发的生长速度和毛囊大小^[3-4]。毛乳头细胞功能异常时，其分泌功能受到影响，引起毛囊周期异常，最终导致脱发^[5-7]。由此可见，毛乳头细胞的正常细胞功能在毛囊稳态维持中占据核心地位，其异常调控是脱发发生与发展的关键机制之一。

线粒体作为细胞能量代谢和信号调控的核心细胞器，其功能状态对毛乳头细胞的活性与毛囊再生能力具有决定性作用。毛乳头细胞的正常功能依赖于充足的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）供应，用以支持细胞分泌生长因子、合成细胞外基质以及维持与毛母细胞的信号交流^[1]。线粒体膜电位（ΔΨ_m）的稳定是维持氧化磷酸化和能量产生的关键指标。当线粒体膜电位下降时，毛乳头细胞会出现能量不足、活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量积累和凋亡倾向，从而削弱毛囊诱导能力^[8]。近年来的研究表明，线粒体功能状态不仅关乎细胞能量的供给，还直接调控Wnt/β-catenin 等关键信号通路的活化，进而影响毛囊的生长周期[8]。此外，线粒体生物发生与代谢适应能力[ 如过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅助活化因子1α（peroxisome proliferatoractivated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α） 和AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路的调控]在维持毛乳头细胞稳态中同样不可或缺^[9]。有研究表明，脱发的形成过程涉及毛乳头细胞的线粒体功能改变^[10] ；而通过改善毛乳头细胞的线粒体功能可以有效地减缓脱发进程中毛乳头细胞的损伤^[11]。因此，改善或保护毛乳头细胞的线粒体功能，有助于提升其分泌能力和毛囊再生潜能，为防治脱发提供潜在的干预靶点。

近年来，侧柏叶提取物、腺苷和米诺地尔成为研究和应用较多的3 类防脱活性成分。侧柏叶提取物作为传统中药来源的植物成分，可通过促进毛乳头细胞的增殖和迁移等，显著促进毛囊进入生长期并改善毛囊结构^[12-13] ；腺苷通过激活腺苷受体信号，促进Wnt/β-catenin 信号通路活化和下游生长因子的分泌，延长毛囊生长期，从而发挥防脱效果^[14-16] ；米诺地尔作为美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的经典防脱药物，通过扩张毛囊周围血管、改善局部供血，并通过调控毛乳头细胞的ATP 敏感钾通道与Wnt/β-catenin 通路促进毛囊再生^[17-18]。鉴于线粒体对毛乳头细胞生命进程的关键作用，建立基于线粒体功能的活性评价体系至关重要。为此，本研究聚焦于线粒体这一核心细胞器，系统比较了侧柏叶提取物、腺苷和米诺地尔对毛乳头细胞线粒体功能的调控差异，并评估其在生理条件下维持毛乳头细胞功能的能力，以期为靶向线粒体的防脱干预策略提供理论依据。

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 仪器与设备

3111-GP 二氧化碳培养箱（美国赛默飞世尔科技公司）；CKX53 荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；SynergyH1 多功能微孔板检测仪（美国伯腾仪器有限公司）；Cytation 5 细胞成像多功能检测系统（美国伯腾仪器有限公司）；CFX Connect 实时荧光定量PCR 仪（ 美国Bio-Rad 公司）。

1.1.2 试剂与耗材

DMEM 高糖培养基（美国Gibco 公司，批号3124467）；胎牛血清（美国Gibco 公司，批号2446608）；青霉素- 链霉素（ 美国Gibco公司， 批号242480）；JC-1 线粒体膜电位探针（上海碧云天生物技术股份有限公司，批号A137241219）；过氧化氢（ 广东光华科技股份有限公司， 批号20220629）；CCK-8 试剂盒（上海陶术生物科技股份有限公司，批号P25041001332）；HiScript II QRT SuperMix逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号7E1190G5）；ChamQ SYBR MasterMix 试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号7E0350F5）；TRNzol Universal 总RNA提取试剂[ 天根生化科技（北京）有限公司，批号B0723A01] ；0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液（美国Gibco 公司，批号3137965）。

1.1.3 细胞与化合物

人永生化头皮毛囊真皮乳头细胞KNU-201（浙江美森细胞科技有限公司）；15% 侧柏叶提取物[ 广州诺葳生物科技有限公司，规格：总黄酮含量（以芦丁计）为5.2%，槲皮苷含量为0.85%，批号20250627] ；100% 腺苷（通辽梅花生物科技有限公司，批号1231108021）；米诺地尔（Kumar Organic Products Limited，批号K007.1/23/02/093）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与实验分组

将冻存的人永生化头皮毛囊真皮乳头细胞KNU-201 细胞复苏后，用含10%（体积分数）胎牛血清、1×10⁵ U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素的DMEM 高糖培养基，于37℃、5%（体积分数）CO₂ 的二氧化碳培养箱中培养。当细胞贴壁生长，汇合度超过80% 时，用2.5 mg/ml 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液进行消化传代，取对数生长期细胞用于试验。试验细胞均取4~15 代的 KNU-201。

细胞活力实验中，分组为对照组，侧柏叶提取物组（0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%）、腺苷组（0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%）及米诺地尔组（0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1.0%）。

线粒体膜电位实验中，分组为对照组，侧柏叶提取物组（0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%）、腺苷组（0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%） 及米诺地尔组（0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%）。

基因表达实验及三维球体聚集实验中，分组为对照组，侧柏叶提取物组（0.1%）、腺苷组（0.01%）及米诺地尔组（0.01%）。

过氧化氢损伤实验中，分组为对照组，造模组（600 μmol/L 过氧化氢处理24 h）、侧柏叶提取物组（600 μmol/L 过氧化氢处理24 h 后，用0.1% 侧柏叶提取物处理）、腺苷组（600 μmol/L过氧化氢处理24 h 后，用0.01% 腺苷处理）及米诺地尔组（600 μmol/L 过氧化氢处理24 h 后，用0.01% 米诺地尔处理）。

1.2.2 细胞活力检测

细胞培养操作同“1.2.1”。将KNU-201 细胞以7×10⁴ 个细胞/ml 的密度接种于96 孔板，培养过夜后加入100 μl 含或不含样品的新鲜DMEM 高糖培养基。继续培养24 h 后按试剂盒说明加入CCK-8 工作液，于450 nm 波长下测定吸光度。细胞活力（%）= 样品组吸光度/ 对照组吸光度×100%。

1.2.3 线粒体膜电位检测

细胞培养操作同“1.2.1”。将KNU-201 细胞以7×10⁴ 个细胞/ml 的密度接种于96 孔板，培养过夜后加入100 μl 含或不含样品的新鲜DMEM 高糖培养基。继续培养24 h 后按试剂盒说明配置JC-1 染色液，将培养板中含有样品的旧培养基弃去，用JC-1 染色液孵育30 min。随后，用试剂盒自带缓冲液洗涤后，更换为新鲜的DMEM 高糖培养基。于CKX53 荧光倒置显微镜下检测红色荧光（聚合型JC-1）与绿色荧光（单体型JC-1），计算红/ 绿荧光比值。

1.2.4 基因表达分析

采用逆转录-定量聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测α-SMA、β-catenin、AMPK、DKK1、HIF-1α、SOX2和STAT3等因子的基因表达。将KNU-201 细胞以5×10⁴ 个细胞/ml 的密度接种于12 孔板中，培养24 h。然后，弃去培养基，加入1 ml 含或不含样品的新鲜DMEM 高糖培养基，继续培养24 h。使用TRNzol Universal 总RNA 提取试剂从KNU-201 细胞中提取总RNA。随后， 使用HiScript II QRT SuperMix 逆转录试剂盒，并根据说明书将RNA 反转录为cDNA。以cDNA 为模板，使用ChamQ SYBR MasterMix 试剂盒在CFX Connect 实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应。每个反应重复3 次。以 18S基因作为内参。qPCR 扩增程序如下：94℃，5 s；60 ℃，15 s ；72 ℃，10 s ；94 ℃，5 s ； 72 ℃，10 s；40 个循环。基因的相对表达水平采用2^-ΔΔCt法进行计算。所用引物序列见表1。

1.2.5 三维球体培养模型建立与形态分析

细胞培养操作同“1.2.1”。当细胞贴壁生长至汇合度超过80% 时， 用2.5 mg/ml 胰蛋白酶 -EDTA 溶液进行消化。将细胞密度调整为5×10⁴ 个细胞/ml，接种30 μl 于培养皿盖上，倒置培养72 h。将液滴中小球吸至96 孔板中，加入100 μl 含或不含样品的新鲜DMEM 高糖培养基，继续培养72 h。最后，于显微摄像系统中进行明场照片拍摄，并使用Image J 软件进行分析。

1.2.6 过氧化氢损伤模型构建与细胞活力恢复实验

细胞培养操作同“1.2.1”。将KNU-201 细胞以7×10⁴ 个细胞/ml 的密度接种于96 孔板，培养过夜后，对照组加入100 μl 不含600 μmol/L 过氧化氢的新鲜DMEM 高糖培养基，其余造模组、侧柏叶提取物组、腺苷组及米诺地尔组加入100 μl 含600 μmol/L 过氧化氢的新鲜DMEM高糖培养基，继续培养24 h。将对照组和造模组培养基更换为100 μl 不含样品的新鲜DMEM 高糖培养基，将样品组培养基更换为100 μl 含样品的新鲜DMEM 高糖培养基，继续培养24 h。按CCK-8 试剂盒说明书加入CCK-8 工作液，于450 nm 波长下测定吸光度。

1.2.7 统计学分析

采用R 软件进行统计学分析，数据以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

2.1 防脱活性成分对毛乳头细胞活力的影响

使用CCK-8 试剂盒检测侧柏叶提取物、腺苷和米诺地尔对毛乳头细胞的细胞活力的影响，结果如图1 所示。侧柏叶提取物在0.01%~0.10%的质量体积分数浓度区间下具有显著的促毛乳头细胞活力作用，其中0.10% 浓度作用最强（图1A）。腺苷在0.01% 浓度下具有显著的促毛乳头细胞活力作用，其余浓度下对细胞活力无显著影响（图1B）。米诺地尔在0.01%~0.10% 的质量体积分数浓度区间下具有显著的促毛乳头细胞活力作用，其中0.01% 浓度作用最强（图1C）。基于上述结果，后续实验选用0.10% 侧柏叶提取物、0.01% 腺苷及0.01% 米诺地尔，以评估各成分在有效浓度下对其他细胞功能的影响。

2.2 防脱活性成分对毛乳头细胞线粒体膜电位的影响

使用JC-1 线粒体膜电位探针检测侧柏叶提取物、腺苷和米诺地尔对毛乳头细胞线粒体膜电位的影响，结果如图2 和图3 所示。JC-1 线粒体膜电位探针在低膜电位时以单体形式存在，发绿色荧光；在高膜电位时会在线粒体基质内聚集形成 J-聚集体，发红色荧光。通过计算红/ 绿荧光比值可以反映线粒体膜电位的变化：比值高说明膜电位高、线粒体功能正常；比值低说明膜电位下降、可能存在损伤或去极化。由图2A 可知，侧柏叶提取物在0.05% 和0.10% 的质量体积分数浓度下能够显著提高线粒体膜电位。而腺苷和米诺地尔在能增强细胞活力的浓度区间下对线粒体膜电位并无显著影响（图2B 和图2C）。由图3 也可以看出，经0.10%侧柏叶提取物处理后，细胞红色荧光信号明显增强，表明其对线粒体膜电位具有提升作用。

2.3 防脱活性成分对毛乳头细胞特征基因及代谢相关基因表达的影响

使用RT-qPCR 法检测侧柏叶提取物、腺苷和米诺地尔对毛乳头细胞基因表达的影响。毛乳头细胞的发育过程需要多种特征因子的表达。β-catenin（由基因CTNNB1 编码）通过Wnt 信号促进毛乳头细胞增殖、维持诱导能力并调控毛发生长^[19] ；SOX2（由基因SOX2 编码）会在毛乳头细胞发育过程中维持毛乳头干细胞特性，并决定发育的毛发类型^[20-21] ；STAT3（由基因STAT3编码）介导细胞因子和炎症信号，可调控毛乳头细胞功能和应激反应^[22] ；DKK1（由基因DKK1 编码）是毛乳头细胞发育过程中的抑制因子，会通过抑制Wnt 信号，降低毛乳头诱导能力并促进毛发停止生长^[23-24] ；α-SMA（由基因ACTA2 编码）能支持毛乳头细胞的结构张力，但其表达水平过高会使得毛囊结构刚性过强，导致毛囊纤维化^[25] ；AMPK（由基因PRKAA2 编码）作为细胞能量感受器，在细胞能量代谢平衡中起着关键的调节作用。并且有研究表明AMPK 可以通过抑制β-catenin的降解并增强其在细胞核内的积累，发挥防脱效应^[26]。HIF-1α（由基因HIF1A 编码）是缺氧诱导因子，会促进血管新生和胶原蛋白、弹性蛋白的生成，研究表明其能通过促进毛乳头细胞生长发挥防脱作用^[27]。

如图4A-E 所示， 与对照组相比，0.10%侧柏叶提取物能够显著上调CTNNB1、SOX2 及STAT3 的表达，同时下调DKK1 与ACTA2 的表达，提示其不仅能促进毛乳头细胞的发育，还可能通过抑制DKK1和降低纤维化倾向发挥防脱作用。

此外，毛乳头细胞的代谢状态与其线粒体功能维持密切相关。例如，HIF-1α（由基因HIF1A 编码）会响应环境氧含量变化，直接调节毛乳头细胞中毛发生长基因表达，从而影响毛乳头细胞的代谢和毛发生长^[27-28] ；AMPKα2（由基因PRKAA2 编码）是细胞内重要的能量调节因子，通过感应细胞内的能量状态，调控毛乳头细胞的代谢和自噬^[29]。如图4F 及图4G 所示，0.10% 侧柏叶提取物能够上调HIF1A 及PRKAA2 的表达，从而增强毛乳头细胞的代谢能力。

0.10% 侧柏叶提取物对CTNNB1、SOX2、STAT3 及HIF1A 的上调及ACTA2 的下调能力弱于0.01% 腺苷，但二者对PRKAA2 的调节能力接近，并且0.10% 侧柏叶提取物的DKK1 下调能力强于0.01% 腺苷，表明侧柏叶提取物可能通过减弱对毛乳头发育的抑制来发挥其防脱作用。

2.4 防脱活性成分对毛乳头细胞三维球体聚集程度的影响

毛乳头作为毛囊底部的球状结构，在正常生理状态下会通过聚集形成球体。毛乳头细胞通过倒置培养的方式，可在体外形成球状结构；通过对球状结构致密度维持能力的检测，可判断不同成分对维持毛乳头球状结构的支持能力。

悬滴培养显示，对照组在72 h 时球体边缘出现松散，形态不规则；经0.10% 侧柏叶提取物处理的球体内部颜色加深，表明细胞密度增加，且球体结构保持紧密聚集（图5）。相比之下，经0.01%腺苷或0.01% 米诺地尔处理的球体边缘呈现松散状态，无法维持致密结构。

对活性成分处理72 h 后的明场拍摄的球体平均灰度进行统计（图6），发现0.10% 侧柏叶提取物能显著维持球体的平均灰度，表明0.10% 侧柏叶提取物可有效地维持毛乳头细胞球状结构的致密程度。

2.5 防脱活性成分对过氧化氢损伤后毛乳头细胞活力的影响

过氧化氢（H₂O₂）是一种常用的氧化应激诱导剂，可在体外模拟毛乳头细胞在脱发相关环境下的损伤状态，如自由基积累、细胞功能下降及凋亡增加等。通过过氧化氢处理构建毛乳头细胞损伤模型，可以在可控条件下模拟毛囊受损过程，评估氧化损伤情况下毛乳头细胞的细胞活力及不同活性成分对细胞活力的恢复作用。如图7 所示，造模组在600 μmol/L 过氧化氢处理24 h 后再正常培养，其细胞活力与未经过过氧化氢处理的组别相比有显著下降。与造模组相比，在600 μmol/L 过氧化氢处理24 h 后，0.10% 侧柏叶提取物可显著提升毛乳头细胞的活力，其恢复程度大于0.01% 腺苷及0.01% 米诺地尔。

侧柏叶提取物、腺苷及米诺地尔均在一定浓度下可上调毛乳头细胞活力。侧柏叶提取物在活性浓度下可显著增强永生化毛乳头细胞的线粒体膜电位，其效果优于腺苷或米诺地尔。活性浓度下侧柏叶提取物对毛乳头细胞特征因子及代谢相关的基因表达上调能力与腺苷接近，但侧柏叶提取物对DKK1 基因的抑制效果强于腺苷。侧柏叶提取物可以更有效地维持三维球体培养模型的致密度，并且对过氧化氢造成氧化损伤后的毛乳头细胞活力具有更优的恢复效果。

综上所述，侧柏叶提取物通过增强线粒体功能、调控毛发生长相关基因表达、维持细胞三维结构及抵抗氧化损伤等多重途径发挥防脱作用，其作用机制具有多靶点、多通路的特点。未来可针对其能量代谢调控等方面发现更多对防脱具有显著作用的活性成分及进行调控机制的深入研究。

许耀豪，博士，暨南大学生命科学技术学院。专业方向：细胞功能研究及活性成分评价

刘忠，博士，暨南大学生命科学技术学院，研究员。专业方向：炎症与自身免疫性疾病靶向创新药物研究与开发，医学与化妆品用途生物基础材料的绿色生物制造、功能性化妆品研究与开发