Nature Biotechnology：复旦大学汪凌波/张锋合作开发供体互补型先导编辑DoPE，实现无疤痕千碱基级和文库级DNA精准插入

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

精准的靶向 DNA 插入是基因功能分析、疾病模型构建、细胞治疗与基因治疗开发的核心技术。传统的同源定向修复（HDR）依赖 Cas9 诱导的 DNA 双链断裂（DSB）启动重组，不仅编辑效率低，还易引发染色体重排、p53 介导的 DNA 损伤应答，在干细胞、免疫细胞等治疗级细胞中应用风险显著。

先导编辑（Prime Editing，PE）是一种 DSB-free 编辑技术，可精准实现小片段的插入、替换与缺失，但标准系统仅能高效编辑 ～50 bp 以内的序列；双 pegRNA 先导编辑系统（Twin-PE）虽拓展了插入范围，但仍局限于亚千碱基级别。依赖重组酶/转座酶的两步法（例如 PASSIGE、PASTE）虽可实现千碱基级插入，但会留下 attL/attR 等外源连接疤痕，且需要额外表达重组酶，操作繁琐、递送负担重。更关键的是，如何实现文库规模的多样化序列原位插入/替换还存在重要挑战。

2026 年 8 月 28 日，复旦大学汪凌波研究员、张锋教授作为共同通讯作者（方允正、唐敬尧为共同第一作者）在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Donor-complementary prime editing enables precise kilobase and library-compatible DNA insertions 的研究论文。

该研究开发出了一种供体互补型先导编辑技术——DoPE（Donor-complementary Prime Editing）。该技术无需 DNA 双链断裂（DSB）、无需外源重组酶/转座酶，仅通过一步反应即可实现长达 12.5 kb 的 DNA 序列精准插入，同时兼容文库级原位饱和诱变，为功能基因组筛选、基因治疗、合成细胞工程等领域提供了强有力的工具。 

汪凌波团队提出“供体-基因组互补退火” 设计思路，对双 pegRNA 先导编辑系统进行了两大改造——

1. 引入 3' 突出端双链 DNA 供体（3'-overhang double-stranded DNA，odsDNA），作为插入片段的载体，两端带有单链 3' 突出端；

2. 设计一对突出端互补型 pegRNA（opegRNA），其逆转录模板（oRTT）区域可转录出与 odsDNA 突出端完全互补的基因组 3' 单链 flaps。搭配经核定位信号优化的 PE2* 先导编辑器，三者共同构成 DoPE 系统：编辑器在靶位点切割 DNA，由 opegRNA 模板逆转录出基因组 3' flaps，与 odsDNA 供体两端的 3' 突出端互补退火，最终完成序列的精准插入。全程不产生 DSB，也无需任何外源重组酶或转座酶，插入位点无外源序列疤痕。

图1. DoPE 示意图

研究团队首先在 ACTB-EGFP 荧光报告系统中完成测试：通过测试 10~42 nt 不同长度的供体突出端，发现约 30 nt 的突出端可实现最高的精准插入效率（13.00%）。一系列对照实验证实，缺失 opegRNA、odsDNA 或逆转录酶活性均无法实现靶向插入，验证了 DoPE 的作用机制严格依赖三者的协同作用。

随后，研究团队在 VEGFA、AAVS1、TP53、DMD、EMX1、HEK3 等不同基因组位点独立测试，均检测到了正确的 DNA 靶向插入。在细胞类型覆盖上 DoPE 不仅在 HEK293T 细胞中有效工作，还成功在人胚胎干细胞（hESC）、诱导多能干细胞（hiPSC）、骨髓间充质干细胞（hBMSC）、HeLa 细胞中实现精准插入。特别值得关注的是，DoPE 可通过“mRNA +化学合成 ssDNA”的全 RNA/单链 DNA 格式递送，规避了双链 DNA 引发的细胞天然免疫反应，为体内治疗与临床级细胞编辑提供了可能的递送方案。

DoPE 最重要的特性之一，是仅需一对 opegRNA，即可通过更换供体序列，在同一位点实现任意多样化的序列插入，兼容文库级高通量筛选应用。研究团队构建了包含 278 种氨基酸替换的供体文库，仅用一次转染，就在靶位点成功回收了 96%-100% 的目标变异，实现了氨基酸分辨率的原位饱和诱变；进一步构建单核苷酸分辨率文库（849 种变异），插入覆盖率可达 85.87%-99.41%。结合 FACS 分选，可直接富集功能缺失与中性突变，为原位功能基因组筛选提供了无 DSB 干扰的全新平台，尤其适用于对 DNA 损伤高度敏感的干细胞体系。

针对基因大小片段的插入需求，团队通过 PCR 扩增结合 λ 核酸外切酶消化制备长片段 odsDNA 供体，成功实现了从 0.33 kb 到 12.5 kb 不同长度片段的精准插入。研究同时发现，同时抑制 NHEJ 和微同源介导的末端连接（MMEJ）通路，可将 DoPE 编辑效率提升 1.47-1.65 倍。

为探索 DoPE 的临床治疗潜力，研究团队以多囊肝致病基因 PRKCSH 为模型，验证了突变不依赖型基因矫正方法：无需针对每种突变单独设计编辑工具，而是通过替换整个突变外显子区域，统一矫正不同类型、不同位置的致病突变。结果显示，无论是单外显子替换还是双外显子同时替换，DoPE 均可成功修复携带不同突变的细胞系，稳定恢复 PRKCSH 蛋白的表达；单外显子矫正效率可达 16%-19%。全基因组脱靶分析表明，插入事件高度富集于靶位点，无明显脱靶整合，证明了技术的安全性。

DoPE 技术实现了一步法、无 DSB、无重组酶、文库兼容的千碱基级 DNA 精准插入，该技术不仅为功能基因组学研究提供了原位饱和诱变的新工具，更为单基因病的基因治疗提供了通用型思路。此外，DoPE 在 CAR-T 细胞定点整合、干细胞工程、农作物基因组改良等领域也具有应用前景。

课题组招聘：

汪凌波为复旦大学研究员、博士生导师，国家优青。因课题组发展需要，欢迎青年才俊加入课题组从事博士后研究，也欢迎优秀学子报考本课题组攻读复旦大学博士学位。联系人：汪老师（邮箱wanglingbo@fudan.edu.cn）。实验室地址：复旦大学江湾校区。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-026-03296-w

设置星标，不错过精彩推文

开放转载

欢迎转发到朋友圈和微信群

 微信加群 

为促进前沿研究的传播和交流，我们组建了多个专业交流群，长按下方二维码，即可添加小编微信进群，由于申请人数较多，添加微信时请备注：学校/专业/姓名，如果是PI/教授，还请注明。

点在看，传递你的品味