寡核苷酸CMC必看：结构精细化表征全攻略，从新规到技术全覆盖

发布时间：2026-09-09来源：药事纵横

1、摘要

寡核苷酸药物因其独特的化学与生物学特性，其质量研究需突破传统小分子化药与生物制品的分析范式。从分类属性来看，合成寡核苷酸既不完全隶属于ICHQ6A合成原料药范畴，也不完全归类于ICHQ6B生物技术产品，因此存在特定的监管技术空白。

随着全球研发进程的深入，各国监管机构与行业组织相继出台了专属指导文件。在监管层面，欧洲药品管理局（EMA）于2024年7月发布了《寡核苷酸的开发与生产指南》，中国国家药品监督管理局（NMPA）则在2026年2月正式实施《化学合成寡核苷酸药物（创新药）药学研究技术指导原则（试行）》。在行业组织层面，美国主导的寡核苷酸安全工作组（OSWG）及欧洲主导的欧洲制药寡核苷酸联盟（EPOC）亦发布了多项共识性技术指南。

为系统梳理上述规范的演进脉络，下表汇总了2015至2026年间国内外主要的寡核苷酸药物质量相关指导文件。

基于对国内外指导原则的精准解读，并结合近年来寡核苷酸药物质量研究的前沿进展，本文将从结构精准表征维度，展开综述，不足和缺陷之处，望同行批评指正。

2、结构精准表征方面

寡核苷酸药物的分子属性由精准序列、化学修饰类型及空间构象共同决定，完整的结构表征是开展后续质量研究、质量标准建立及质量控制的前提与基础；分子量确证常采用高分辨质谱（HRMS，如Orbitrap、Q-TOF）精确测定完整分子量，常规检测精度可达0.1Da，是确认目标分子化学组成、验证预期修饰的关键初始步骤，序列验证则通过LC-MS/MS序列分析，经核酸酶P1酶解或温和化学裂解将寡核苷酸切割为小片段，结合串联质谱解析碎片离子实现从头测序并精确定位修饰位点。同时对固相合成粗品开展失败序列分析，鉴定偶联失败产生的截短序列（如n-1、n-2）以反向推导并验证目标序列合成路径。共价修饰鉴定与定量需明确硫代磷酸酯键、2′-修饰（OMe、F、MOE等）、5-甲基胞嘧啶等特定修饰的存在与比例，可采用自下而上酶解结合LC‑MS/MS为主，NMR/HRMS为辅的检测手段进行分析，而偶联分子作为寡核苷酸经共价键、连接子与功能分子定点结合形成的杂合分子，可改善递送、靶向、药代及稳定性等成药性问题，应采用质谱、核磁、片段分析等手段对比偶联前后二级结构差异，确保偶联未破坏空间结构且不影响活性，若不进行比较则需具备充分科学依据。

2.1、分子量测定

目前寡核苷酸药物分子量确证主要采用高分辨质谱（HRMS），常用质量分析器包括Orbitrap（轨道阱）与Q-TOF（四极杆-飞行时间）等；离子源以电喷雾电离（ESI）为主流，也可选用基质辅助激光解吸电离（MALDI），其中ESI因适配液质联用（LC-MS）、适合多电荷电离与复杂样品分析，在药物质量研究中应用最广泛。

由于寡核苷酸的磷酸骨架（及其类似物如硫代磷酸酯）在溶液中通常带强负电荷，因此在电喷雾质谱（ESI-MS）等软电离技术中，常采用负离子检测模式进行分析，以便更高效地产生带负电荷的分子离子（如[M−nH]ⁿ⁻），从而获得高信噪比、准确的分子量信息。

以22-merRNA为例，采用LC-MS-MS对其进行分子量鉴定，如下图所示，可见一系列特征多电荷离子峰，标注了对应电荷态 z 值；局部放大插图可清晰分辨‑5 电荷态下完整的同位素峰簇。经软件解卷积处理后得到下方零电荷分子量谱图，主峰实测分子量为 6861.7 Da，与该寡核苷酸理论单同位素分子量高度吻合。

图a

图b

2.2、一级序列表征

寡核苷酸的质谱裂解特征如下图所示，可通过a/b/c/d及w/x/y/z多条特征路径生成系列特异性碎片，碎片的形成机制涵盖糖环断裂与磷酸酯骨架裂解，其中2′-3′环磷酸酯为RNA特征碎片。

以短序列RNA为例，采用ESI‑MS/MS进行分析，骨架在第4位腺嘌呤处断裂，产生5'端和3'端\碎片二级谱可观测不同电荷态的a‑B、w系列碎片、碱基丢失离子与游离碱基离子。

2.3、酶处理协助表征

对于序列长度较长（>20mer）或存在复杂修饰（硫代磷酸酯、2'-F、2'-OMe、LNA等混合修饰），单独的质谱定性无法准确表征其结构时（如部分质谱信号较弱等），需进行酶处理后质谱定性，同时对固相合成粗品开展失败序列分析，鉴定偶联失败产生的截短序列（如n-1、n-2）以反向推导并验证目标序列合成路径的正确性。

以合成31聚RNA（平均分子量10044 Da）经SVP酶解2 min后的负离UV‑MALDI‑TOF质谱研究为例。酶解产生一组阶梯式片段，所有片段均保留原始5′‑末端。可通过相邻峰之间的质量差推导序列信息。

2.4、NMR协助表征

对于PS修饰，2′-修饰（OMe、F、MOE等）、5-甲基胞嘧啶等特定修饰的存在与比例的确定，需二级质谱结合多维度NMR协同分析，关于PS修饰，通过³¹P-NMR化学位移及积分分析，确证PS修饰的存在与比例，通过¹H-³¹PHMBC实验验证了PS键与相邻糖环的连接位点；关于2′-修饰，有文献通过¹H-NMR/¹⁹F-NMR特征信号及二维耦合实验，确证2′-OMe/2′-F修饰的存在与糖环位点，未检测到非预期修饰信号；关于碱基修饰，有文献通过¹H-NMR中5-甲基胞嘧啶的特征甲基信号及NOESY耦合关系，确证碱基修饰的存在与位点。

31PNMR谱图中可以观测到样品结构中磷酸骨架上磷信号，硫代磷酸酯键（P=S）的磷化学位移在54.79~54.12 ppm，而磷酸酯键（P=O）的磷化学位移在-0.95~-1.53 ppm，从31PNMR谱中可以得出样品中存在硫代磷酸酯键与磷酸酯键，其比例约为6：38，与工艺预期一致。

2.5、偶联位点表征

对于偶联位点表征，用LC‑MS/MS、NMR、酶切质谱等，确认只有一个位点发生共轭。采用CD、Tm熔解曲线、SEC色谱等对配体连接前后样品进行对比分析，明确寡核苷酸有没发生异常折叠、聚集、双链破坏等结构变化。

在共价偶联位点层面，酶切质谱，采用位点特异性核酸酶将偶联产物酶解为特征片段，通过LC-MS比对各片段理论与实测分子量，定位偶联发生的具体片段与位点，适合长链寡核苷酸的位点定位；NMR谱：通过¹H、³¹P或¹⁹FNMR观测偶联前后特征化学位移变化，结合NOE谱进行空间位点归属，从溶液共价结构层面正交验证偶联位点与数目。

在高级结构与完整性层面，通过圆二色谱对比偶联前后的二级结构特征、Tm熔解曲线考察分子热力学稳定性变化、SEC-MALS分析分子量分布与聚集状态，明确配体连接后寡核苷酸未发生异常折叠、双链破坏或非预期聚集等结构改变，多技术交叉验证充分保障偶联产物的结构正确性与质量可控性。

3、参考文献

[1] Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products.

[2] McLuckey S. A. S. Habibi‑Goudarzi，Journal of the American Chemical Society, 1993, 115 (25):12085‑12095.

[3] Tolson D. A. & Nicholson N. H.,Nucleic Acids Research, 1998,26:446‑451.

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