Sci Adv：在“分子泵”里看见一条新路，武汉大学龙凤团队破解铜绿假单胞菌MexJK外排通路

铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性机会性病原体，并且是包含粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属（ESKAPE）的病原体群体的成员。这些病原体由于其对抗菌药物不断升级的耐药性而对人类健康构成严重威胁。

免疫缺陷患者中铜绿假单胞菌感染的高死亡率仍然是全球健康问题，并因该菌的内在和获得性耐药机制而进一步复杂化。多药外排系统是促成多药耐药的主要机制之一，而耐药-结节-细胞分裂（RND）家族外排泵的过表达赋予了铜绿假单胞菌中大部分的多药耐药。

RND外排泵在革兰氏阴性菌中组装成一个三部分系统，该系统跨越内膜和外膜，由三个组分组成，包括利用质子驱动力作为底物运输能量来源的RND家族内膜蛋白（IMP）、连接到细胞外空间的外膜蛋白（OMP），以及桥接IMP和OMP的膜融合蛋白（MFP）。所有三个组分对于多种底物的有效外排都是不可或缺的。

在铜绿假单胞菌中共鉴定出12种RND外排泵。其中，MexJK外排泵是通过使用三氯生作为选择剂从敏感菌株中分离三氯生耐药突变体而鉴定的。MexK是属于疏水-亲脂外排-1（HAE-1）RND家族的IMP，MexJ作为其MFP伙伴。定义的mexJK操纵子不编码OMP。

MexJK外排泵可通过与不同OMP（如OprM和OpmH）组装来介导多种耐药性。MexJK-OpmH复合物主要负责三氯生外排，而MexJK-OprM参与促进红霉素和四环素耐药性。在铜绿假单胞菌的RND外排泵中，MexJK与TriABC复合物具有最高的同源性（MexK与TriC：45.5%同一性，64.8%相似性；MexJ与TriA/TriB：32.3/32.8%同一性，49.7/49.1%相似性）。

与MexJK类似，TriABC也通过三氯生选择高敏感突变体而被鉴定，并与OpmH形成功能性复合物以介导三氯分外排。与铜绿假单胞菌中赋予对广谱多种抗菌药物耐药的MexAB-OprM、MexXY-OprM和MexCD-OprJ等外排系统不同，MexJK-OpmH和TriABC-OpmH表现出窄底物特异性，主要介导三氯分外排。

图1.apo-MexK和MexJK-Tri的整体结构（摘自

Science Advances

）

迄今为止，已确定了众多HAE-1 RND转运蛋白的结构，包括来自大肠杆菌的AcrB和AcrD、来自肺炎克雷伯菌的AcrB和OqxB、来自铜绿假单胞菌的MexB、MexY和TriC、来自鲍曼不动杆菌的AdeB和AdeJ、来自淋病奈瑟菌的MtrD、来自空肠弯曲杆菌的CmeB、来自类鼻疽伯克霍尔德菌的BpeB和BpeF，以及来自大肠杆菌的MdtF和MdtB。

这些RND转运蛋白通常以三聚体形式发挥作用，每个原聚体由一个含质子中继网络的12次跨膜α螺旋结构域和一个含药物结合口袋的大周质结构域组成。在三部分外排系统的经典组装中，MFP通过周质相互作用将三聚体RND泵桥接到三聚体OMP。

每个MFP原聚体表现出延长的柔性，具有四个线性排列的结构域，包括膜近端（MP）、β桶、脂酰基和α螺旋发夹结构域，并可通过N端脂化锚定至内膜。MFP可形成六聚体加帽环结构，连接到三聚体OMP结构的圆柱尖端，该结构具有一个跨膜β桶结构域、一个周质α桶结构域和一个赤道结构域。

完全组装的RND三部分复合物沿中心轴跨细胞被膜形成连续的药物外排出口通道。然而，完全组装的RND三部分复合物的实验确定结构仍然稀缺。

在与底物复合的HAE-1 RND外排泵的解析结构中，大多数底物位于周质结构域的近端或远端结合口袋中。某些底物被观察到在跨膜结构域的TM1/TM2和TM7/TM8螺旋之间的中央腔或沟槽中。RND外排泵中的转运机制和途径是多样的，仍有待充分阐明。

在本研究中，作者解析了apo形式以及MexK与MexJ和三氯生复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构。在MexK原聚体的跨膜结构域内鉴定出一个三氯生结合位点，该位点先前从未被报道过。

结构分析、计算模拟和诱变的整合方法揭示了一条先前未被表征的跨膜底物易位途径，沿该途径鉴定了MexK的关键残基。作者进一步证明氯霉素和乙胺嘧啶是MexK的潜在底物，可能遵循相同的途径进行外排。作者的发现为RND外排泵的多样化转运途径提供了结构和功能见解。

参考消息：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aee7036