祝贺！我国院士团队再发Nature，攻克药学领域世纪难题，成功入选年度十大学术进展！

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学习目标： 理解现代蛋白质设计的理论基石，建立从“功能”到“结构”再到“序列”的正确设计观。

蛋白质折叠问题与经典设计：

。回顾“CASP历史”以及蛋白质折叠问题的复杂性 。

。介绍David Baker实验室与IPD的设计哲学：以最终功能为导向，设计自然界不存在的全新蛋白质结构。

。讲解Rosetta软件的核心思想，理解其作为蛋白质设计基石的历史地位与方法论

模块二：核心AI模型原理与代码实现

学习目标：从原理和代码层面，彻底理解驱动现代蛋白质预测与设计的两大核心神经网络架构。

·基础工具与环境：

o掌握Numpy进行多维数组（Tensor）操作 。

o学习PyTorch的核心概念：张量、自动求导机制

o讲解服务器GPU与CUDA的基本工作原理，为后续的本地化部署打下基础。

·关键模型架构拆解：

oTransformer与Attention机制：深入讲解Transformer模型如何通过自注意力机制捕捉序列中的长距离依赖关系，并分析其如何被AlphaFold 2用于整合多序列比对（MSA）信息和空间几何信息，构成Evoformer模块的核心 。

o扩散模型 (Diffusion Model)：详细阐述扩散模型的前向加噪（Forward Process）与反向去噪（Reverse Process）的数学原理 。重点讲解该模型如何被应用于RFdiffusion，实现从高斯噪声中逐步生成结构合理的蛋白质骨架

代码实践：所有模型原理都将配合Jupyter Notebook进行代码实操，确保学员不仅理解理论，更能动手实现。

模块三：前沿设计工具链：原理、部署与应用 

学习目标：掌握当前最高效的蛋白质设计“三要素”工具链，并完成本地化部署，具备独立开展计算设计的能力。

A. 结构生成 (RFdiffusion)：

功能详解：学习RFdiffusion如何从随机噪声中生成全新的蛋白质骨架 。

实操技术：重点讲解几种核心设计模式的应用场景与参数设置：

无条件生成 (Unconditional generation)：用于创造全新的拓扑结构。

基于骨架的生成 (Scaffolding)：在已有的结构骨架上进行延申或构建。

功能位点限定生成 (Inpainting)：在固定关键功能位点（如活性中心、结合界面）的前提下，生成包裹该位点的全新结构。

B. 序列设计 (ProteinMPNN)：o核心问题：讲解“蛋白质反向折叠 (Inverse Folding)”问题的挑战性，即如何为给定的骨架设计出能正确折叠的氨基酸序列 。o协同工作流：演示如何将RFdiffusion生成的骨架（Backbone）作为输入，利用ProteinMPNN设计出高稳定性的氨基酸序列，形成完整的“结构-序列”设计流程 。

C. 结构验证与功能拓展 (AlphaFold 3)：

o精度验证：学习使用AlphaFold 2/3验证由ProteinMPNN设计的序列，能否高精度地折叠回RFdiffusion所设计的初始结构 。重点讲解pLDDT和PAE图的解读，用于评估预测结果的置信度 。

o功能预测：介绍AlphaFold 3的核心突破——其预测能力已从单一蛋白质扩展到蛋白质、DNA、RNA、配体等多种分子的复合物 。探讨如何利用这一特性，初步评估设计的蛋白质与靶点分子的相互作用，为药物设计提供关键信息。

模块四：应用方向专题实战

学习目标：将前面学习的工具链应用到三个主流的生物医药研发场景中，解决具体问题。

总学习目标：通过三个独立的、项目驱动的专题，让学员完整地、端到端地执行计算蛋白质设计的流程。在课程结束时，学员不仅掌握了工具的使用，更能理解在不同应用场景下（酶、抗体、从头设计）的设计策略、关键考量和技术组合。

专题一：从头设计功能性Binder

技术流程：一个完整的综合性项目。学员将选择一个具体靶点，独立运用“RFdiffusion → ProteinMPNN → AlphaFold”的全套技术流程，从零开始设计一个能够特异性结合该靶点的全新小分子蛋白（Binder），完成一个标准化的de novo设计流程。

项目目标：执行一个完整的、工业界标准的de novo设计流程，针对一个选定的蛋白靶点，从零开始设计一个能够特异性结合其表面的全新小分子蛋白（Binder）。

核心概念：De novo设计、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）、形状互补性、计算流程的端到端整合。

技术流程详解：

1.靶点分析与结合位点选择：

o选择一个感兴趣的靶点蛋白（如疾病相关蛋白）。

o分析其表面性质，选择一个适合作为结合靶点的区域（通常是相对平坦、具有一定疏水性的表面）。

2.基于靶点的骨架生成 (RFdiffusion)：

o此为设计的核心创造步骤。学员将学习使用RFdiffusion的功能位点限定生成 (Inpainting)模式。

o将靶点蛋白的结构作为固定的“环境”，RFdiffusion会在此环境的约束下，从噪声中“生长”出一个与靶点表面形状高度互补的全新蛋白质骨架。

3.序列填充与优化 (ProteinMPNN)：

o将上一步生成的最优骨架输入ProteinMPNN。

oProteinMPNN会为这个全新的骨架设计出能够稳定折叠的氨基酸序列，完成从“形状”到“化学本质”的转化 。

4.双重计算验证 (AlphaFold)：

o步骤一：单体验证。将ProteinMPNN设计的序列输入AlphaFold，预测其单体结构。验证该序列能否独立折叠成我们设计的形状（高pLDDT得分，且RMSD与设计模型低）。

o步骤二：复合物验证。使用AlphaFold-Multimer 预测设计的Binder和靶点蛋白的复合物。验证Binder能否如预期般结合到靶点的正确位置（低界面PAE得分）。

项目目标：针对一个给定的酶，通过计算方法，设计出具有更高热稳定性或催化活性的突变体，并提供一套可供实验验证的候选序列。

核心概念：适应性景观 (Fitness Landscape) ，定向进化 ，酶催化与过渡态理论 (Transition State Theory) ，计算诱变 (In-silico Mutagenesis)，折叠自由能 (ΔG)。

技术流程详解：

1.模板选择与结构准备：

o从蛋白质结构数据库（PDB）中选取一个具有已知结构和功能的酶作为改造模板。

o若无实验结构，将学习利用UniProt 寻找同源序列，并使用SWISS-MODEL 或本地AlphaFold进行结构预测，获得可靠的起始模型。

o使用PyMOL 或ChimeraX 分析酶的活性位点、底物结合口袋以及潜在的不稳定区域（如高柔性loop）。

2.计算突变扫描与稳定性预测：

o学习使用Rosetta等工具包中的能量函数，对酶的特定区域（或全长）进行计算饱和突变扫描。

o核心技术点是计算每个突变体相对于野生型的折叠自由能变化 (ΔG)。学员将学习如何解读ΔG值，以筛选出能够提升蛋白质热稳定性的有益突变。

3.催化性能的计算评估：

o对于活性位点附近的突变，将引入分子对接（Molecular Docking）方法，模拟底物或过渡态类似物与突变酶的结合情况。

o通过比较结合能、关键相互作用（氢键、盐桥等）的变化，来半定量地预测突变对催化活性（kcat/KM）的潜在影响。

4.候选突变体的筛选与组合：

o基于上述计算结果，学员将学习如何制定筛选策略，例如，优先选择同时提升稳定性且不损害（或提升）活性的突变。

o探讨如何组合多个有益的单点突变，以获得性能提升更显著的多点突变体。

项目目标：掌握计算辅助的抗体亲和力成熟（Affinity Maturation）流程，针对一个已知的抗体-抗原复合物，设计新的互补决定区（CDR）序列，以增强其结合能力。

核心概念：抗体结构域、CDR与框架区（FR）、抗原表位（Epitope）与互补位（Paratope）、抗体人源化、亲和力与特异性。

技术流程详解：

1.抗体-抗原复合物的结构分析：

o从PDB中选取一个抗体-抗原复合物结构作为起始点。

o利用可视化软件，精确识别构成结合界面的CDR loop，特别是贡献最大的CDR-H3。

o详细分析界面上的氢键、疏水作用、盐桥等关键相互作用，理解亲和力的结构基础。

2.CDR区域的序列设计：

o固定抗体的框架区和抗原结构，仅针对CDR区域进行序列设计。

o学员将使用ProteinMPNN等工具，在保持CDR loop骨架构象的同时，重新设计其氨基酸序列，以期发现能与抗原形成更优相互作用的新序列。

3.利用AlphaFold-Multimer进行复合物结构预测与评估：

o将新设计的CDR序列整合回抗体，形成一个完整的突变抗体序列。

o使用AlphaFold-Multimer 预测新设计的抗体与抗原的复合物结构。这是流程中最关键的一步。

o学员将学习如何解读AlphaFold-Multimer的输出结果，特别是利用PAE（Predicted Aligned Error）图来评估界面预测的置信度，判断新设计的抗体是否仍能以正确的模式结合抗原。

4.亲和力排序与候选筛选：

o通过比较不同设计方案的界面结合面积、预测的氢键网络、以及界面PAE得分等指标，对设计的抗体进行排序。

o筛选出1-3个预测结合能力最强、且结构最可靠的候选抗体序列。

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第一天

启程·洞见药物设计的微观世界 (Vision & Foundation)

上午：理论基石——计算药物设计的思想与方法

·模块一：药物发现的源头——为何蛋白质三维结构至关重要？

o经典方法：同源建模（Homology Modeling）的逻辑与应用

o前沿探索：从头建模（de novo Modeling）的挑战与突破

·模块二：锁定靶心——蛋白质活性位点的识别与意义

o探索药物与靶点的“钥匙-锁”关系

·模块三：分子之舞——优秀药物分子的关键结构特征

o解构小分子药物的构效关系奥秘

·模块四：CADD核心武器库概览

o分子对接（Molecular Docking）：预测分子间的“亲密接触”

o虚拟筛选（Virtual Screening）：在百万分子中“大海捞针”

o分子动力学模拟（Molecular Dynamics）：观测分子的动态行为

o其他前沿计算方法简介

下午：实战预备——可视化工具与数据解读

·模块五：解锁生命蓝图——蛋白质结构数据库（PDB）深度解析

o高效检索：精准定位你的目标蛋白

o信息解读：全面掌握PDB页面信息与生物学含义

o数据获取：标准数据的下载与管理

o破译密码：PDB文件格式的结构化解读

·模块六：PyMOL大师课——从入门到精通的分子可视化

o初识PyMOL：核心功能与界面导览

o基础操作：旋转、缩放、选择与着色

o高级渲染：绘制精美的蛋白/小分子表面图与静电势分布图

o成果展示：精准绘制相互作用图并制作引人注目的科学动画

第二天：构建·从序列到三维结构的创生 (From Sequence to Structure)

上午：同源建模专题——预测未知的蛋白质结构

·模块一：同源建模的原理与应用场景

o何时以及为何选择同源建模？

o揭秘同源建模背后的核心算法

·模块二：Swiss-Model实战工坊

o第一步：通过BLAST等工具寻找最佳同源模板

o第二步：序列比对的艺术与技巧

o第三步：精准选择决定模型质量的蛋白模板

o第四步：自动化与手动搭建蛋白三维模型

o第五步：模型质量的生命线——拉曼图（Ramachandran Plot）分析与解读

o第六步：模型的迭代优化与精修

·案例演练： 以新冠病毒Spike蛋白序列为例，从零开始构建高质量三维结构模型，并进行全流程质量评估。

下午：小分子设计与数据库探索

·模块三：ChemDraw化学绘图实战

o从零开始，构建任意复杂的小分子结构

o一键计算：快速获取分子量、clogP等关键理化性质

o挑战练习：灵活构建大环分子、氨基酸、DNA/RNA片段等特殊结构

·模块四：探索海量的小分子化合物库

o主流数据库巡礼：DrugBank, ZINC, ChEMBL的特色与高效使用技巧

o特色资源探索：天然产物与中药成分数据库的挖掘与应用

第三天：对接·分子间的识别与结合 (The Docking Dance)

上午：分子对接的理论核心

·模块一：解密分子对接的黑箱

o核心原理：计算机如何模拟分子的结合过程？

o对接类型：刚性、半柔性与柔性对接的分类与选择

o评价标准：深入理解不同打分函数（Scoring Function）的物理意义

·模块二：常规分子对接流程实战

o配体准备： 药物小分子的能量最小化与构象优化

o受体准备： 蛋白靶点的预处理（加氢、去水、修复残基）

o定义靶点： 受体结合口袋（Grid Box）的精确计算

o执行对接： 运行高效的半柔性对接任务

下午：对接结果的深度分析与验证

·模块三：结果评估的多维视角

o黄金标准：与晶体结构（co-crystal structure）构象进行对比验证

o能量视角：从结合能与打分函数值评价结合强度

o聚类分析：洞察配体在口袋中的优势结合模式

o决策时刻：如何科学选择最优的结合构象？

·模块四：探索不同的对接策略与软件实现

第四天：进阶·柔性对接与虚拟筛选 (Advanced Docking & Screening)

上午：柔性对接——更真实的分子识别模拟

·模块一：柔性对接的核心流程

o配体的精细化准备与构象生成

o受体准备的特殊考量

o关键一步：定义需要柔性处理的氨基酸残基

o重新定义格点：适应受体柔性的计算盒子

o执行计算并进行结果分析与评估

·模块二：策略选择——半柔性 vs. 柔性对接

o深入比较两种方法的优缺点与适用场景

·模块三：柔性对接的替代实现方案

下午：高通量虚拟筛选——从海量分子中发现先导化合物

·模块四：药物发现的加速器

o小分子文件的“语言”：SDF, MOL2等格式的理解

o瑞士军刀OpenBabel：精通小分子格式的批量转化与处理

·模块五：基于对接的虚拟筛选实战

o流程构建：设计一套完整、高效的虚拟筛选工作

o准备阶段：靶点蛋白的选择与百万级化合物库的获取

o执行阶段：自动化运行高通量对接任务

o结果分析：如何从海量结果中筛选出高潜力的“Hits”分子（Hit Identification）？

第五天：拓展·探索非经典分子相互作用 (Expanding the Horizon)

上午：特殊分子体系的对接挑战

·模块一：小分子-小分子对接

o超越蛋白靶点：探索小分子间的相互作用（例如：药物-糖类）

o独特的结构预处理与对接策略

o案例分析：以糖-小分子对接为例，解读结果并展示

·模块二：蛋白-核酸对接

o探索基因调控与药物干预的奥秘

·模块三：蛋白-蛋白对接（PPI）

otackling a new frontier in drug discovery

下午：QM/MM计算——融合量子化学与经典力学

·模块四：量子化学（QM）基础入门

o理论核心：薛定谔方程的启示

o方法概览：从半经验、HF到后HF方法

o中流砥柱：密度泛函理论（DFT）简介

·模块五：Gaussian计算入门示例

o从分子构建到单点能计算

o结构优化与振动分析

o探索化学反应：过渡态搜索与势能面扫描

·模块六：QM/MM在生物体系中的应用实例分析

o看QM/MM如何精确模拟酶催化反应等复杂过程

第六、七天：升华·分子动力学模拟与自由能计算 (Dynamics & Energetics)

第六天：驾驭Linux与GROMACS——开启MD模拟之旅

·上午：Linux系统基础

o迈入高性能计算的门槛：Linux系统简介

o效率倍增：常用核心命令实操

o软件安装：以GROMACS为例，掌握Linux环境下的程序部署

·下午：MD实战一：溶剂化环境中蛋白质的动态行为

o目标： 全面掌握并亲手操作分子动力学模拟的完整标准流程（力场选择、构建体系、能量最小化、平衡、生产模拟）。

第七天：MD高级应用——配体结合与能量计算

·上午：MD实战二：蛋白质-配体复合物的动力学模拟

o挑战： 学习处理非标准残基（如药物分子）的力场参数化与拓扑文件生成。

·下午：从模拟到定量——MD轨迹分析与自由能计算

o分析模块： 掌握RMSD, RMSF, Radius of Gyration等常用分析方法

o定量模块： 初步接触蛋白-配体结合自由能的计算方法（如MMPBSA/GBSA），定量评估结合强度

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第一天｜AIDD 概述与药物数据库 & Python 环境工具（6h｜理论 3h + 实操 3h）

理论部分（3h）

1.AIDD 人工智能辅助药物设计概述（0.75h） 

·传统药物研发痛点，AIDD 发展背景，小分子药物、抗体 / Nanobody 生物药 AI 研发场景，AI 在药物研发全流程介入位点

·AIDD 技术栈总览：传统机器学习、GNN、NLP 生成模型；课程框架：小分子 + 生物药双主线介绍

2.Python 环境搭建与包管理（0.75h） 

·Anaconda、VSCode、虚拟环境、pip/conda 镜像源配置；AIDD 生态库介绍

3.科学计算库基础（1h） 

·numpy、pandas 分子数据清洗，matplotlib 绘图，requests 网络爬虫

4.药物公开数据库体系（0.5h） 

·ChEMBL、PubChem、KEGG、ChEBI、BiGG；DeepChem & MoleculeNet 数据集；抗体 / Nanobody 相关数据库简单引入（SAbDab 等）

1.AIDD 虚拟环境搭建，库安装调试

2.多数据库批量获取小分子数据：KEGG、ChEBI、PubChem、ChEMBL、BiGG 接口调用

3.DeepChem 安装、MoleculeNet 数据集下载与预处理

4.小作业：批量下载靶点活性分子，输出 csv 数据集

第二天｜传统机器学习辅助药物设计（6h｜理论 3h + 实操 3h）

理论部分（3h）

1.机器学习基础理论（1h） 

·监督 / 无监督 / 强化学习；决策树、SVM、朴素贝叶斯、CNN；药物任务：分类（毒性 ADMET）、回归（活性预测）

2.模型评价指标（0.75h） 

·分类：准确率、精确率、召回率、F1、ROCAUC；回归：MAE、MSE、R²；交叉验证；药物数据集过拟合、数据偏差问题

3.分子表征与化学信息学（1.25h） 

·SMILES、分子指纹、分子描述符、化合物相似性；RDKit 原理；分子构象、RMSD、子结构匹配

实操上机（3h）

1.scikitlearn 完整模型训练、评估、交叉验证流程

2.RDKit 实操：分子读写、绘图、描述符 / 指纹计算、相似度、子结构检索、构象生成与 RMSD

3.项目实战 

·实战 1：Lipinski Ro5、ADMET 规则分子筛选

·实战 2：Tanimoto 相似度配体筛选

·实战 3：分子指纹化合物聚类

·实战 4：机器学习生物活性预测

·实战 5：分子毒性预测模型构建

第三天｜图神经网络 GNN 辅助药物设计（6h｜理论 3h + 实操 3h）

理论部分（3h）

1.图神经网络基础（1.5h） 

·图数据表达：小分子、蛋白复合物；节点 / 边 / 图级预测任务；PyG/DGL/TorchDrug 框架；消息传递，GCN/GAT/GIN 原理

·SMILES 转分子图、蛋白配体复合物图构建逻辑

2.GNN 药物领域任务（1.5h） 

·小分子毒性、属性预测；蛋白配体相互作用预测；拓展：GNN 在抗体、Nanobody 结构预测、CDR 区建模的应用思路；数据集不平衡问题

实操上机（3h）

1.PyTorch+PyG 环境调试，图数据集基础操作

2.实战 1：DeepChem 图卷积实现分子特征提取与属性预测

3.实战 2：PyG 构建分子图数据集，GNN 分子毒性预测

4.实战 3：蛋白配体相互作用预测 

·蛋白配体复合物构建 PyG 图数据集；GIN 模型搭建与相互作用预测

第四天｜NLP 大模型辅助药物化学（6h｜理论 3h + 实操 3h）

理论部分（3h）

1.药物领域 NLP 基础（1.5h） 

·序列向量表示，RNN、Seq2Seq、EncoderDecoder、Attention、Transformer；SMILES 分子语言、化学反应文本表示

2.深度生成模型（1.5h） 

·VAE/GAN/RNN/Transformer 分子生成；化学反应预测；分子 BERT 预训练；抗体序列生成、Nanobody CDR 序列设计的 NLP 模型思路

实操上机（3h）

1.PyTorch 与 Transformer 模块调试

2.实战 1：Seq2Seq 无监督分子表示学习

3.实战 2：Transformer 化学反应表示

4.实战 3：NLP 化学反应分类

5.实战 4：BERT 实现化学反应产率预测

第五天｜综合项目实战：分子生成 + PyMOL 结构可视化 + 抗体 / Nanobody AI 设计（6h｜理论 3h + 实操 3h）

理论部分（3h）

1.RDKit 化学反应计算化学信息（0.5h） 

·SMARTS 语法、反应指纹、反应相似度、AI 分子生成原理

2.蛋白数据库与结构可视化基础（0.75h） 

·PDB、UniProt、SAbDab（抗体数据库）介绍；蛋白序列、三维结构数据；

·PyMOL 原理：蛋白结构渲染、残基选择、结合口袋显示、复合物作图、抗体 CDR 区可视化基础理论

3.抗体与 Nanobody AI 药物设计专题（1h） 

·抗体、Nanobody 结构基础：重链、轻链、CDR 互补决定区；纳米抗体单域蛋白特点

·AI 在抗体药物的任务：序列生成、CDR 设计、亲和力优化、人源化、结构预测、抗原抗体相互作用预测

·主流模型：GNN、Transformer、蛋白大模型在抗体 / Nanobody 的应用；公开数据集 SAbDab、OAS

4.AIDD 完整项目工程流程（0.75h） 

·数据集构建预处理表征训练评估落地；数据集偏差、模型踩坑；小分子 + 抗体药物不同落地思路对比

实操上机（3h）

1.RDKit 化学反应实操：反应解析、绘制、SMARTS 定义反应、产物生成、反应指纹与相似度

2.PyMOL 实操教学（1h） 

1.PDB 结构导入、蛋白链、残基选择操作

2.蛋白配体复合物可视化：结合口袋、小分子配体渲染、氢键 / 疏水相互作用展示

3.抗体 / Nanobody 结构可视化：定位 CDR 区，抗原抗体复合物作图，导出科研级图片

4.Python 脚本调用 PyMOL（pymolapi）批量处理蛋白结构

3.抗体 & Nanobody AI 设计实战（1h） 

1.SAbDab/OAS 数据库下载抗体 / Nanobody 序列与结构数据，数据清洗

2.基于序列大模型做 Nanobody CDR 序列生成、突变设计

3.抗原Nanobody 相互作用简单预测实操

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一、多肽与深度学习设计导论

1. 从氨基酸到多肽（零基础起步）

1.1 氨基酸是什么：从最基础的化学结构讲起，介绍 20 种天然氨基酸的通式——每个氨基酸都由一个中心碳、一个氨基（–NH₂）、一个羧基（–COOH）和一个决定其性质的侧链 R 基组成。按侧链性质把它们归为疏水（如 Ala、Val、Leu、Ile、Phe）、极性不带电（如 Ser、Thr、Asn、Gln）、带正电（Lys、Arg、His）、带负电（Asp、Glu）四大类。课堂上会发一张“氨基酸性质速查表”，让学员对每个字母代表什么性质形成直觉，这是后面理解净电荷、疏水性、两亲性等设计参数的基础。

1.2 肽键与序列方向：讲解两个氨基酸如何通过一个氨基与另一个羧基脱水缩合形成肽键，多个氨基酸首尾相连即构成多肽链。强调序列是有方向的（从 N 端到 C 端读写），这一点在后续做序列生成、突变标注时非常关键。随后介绍单字母与三字母两套代码的对照，并现场带学员把一条真实抗菌肽序列（如 KWKLFKKI）逐个残基读出来，顺便观察它为什么带正电、为什么两亲。

1.3 多肽 vs 蛋白质：从长度（多肽通常在 50 个残基以内）和是否能形成稳定三维折叠两个角度区分二者。重点讲清多肽的“柔性”特点——很多多肽在游离状态下并没有单一固定构象，而是在与靶点结合时才诱导形成稳定结构（诱导契合），这正是多肽结构预测和设计比球状蛋白更棘手的根本原因，也为第二主题的结构预测埋下伏笔。

1.4 多肽的种类：系统介绍线性肽、环肽（头尾环化或二硫键环化）、订书肽（stapled peptide，通过化学桥固定螺旋）、以及含非天然氨基酸或 D-氨基酸的肽。结合配图逐一说明为什么这些结构改造能够显著提升多肽的稳定性、刚性与穿膜能力，让学员在一开始就建立“结构改造是多肽成药关键手段”的整体认识。

2. 多肽为什么重要（治疗性多肽）

2.1 多肽药物的优势与局限：优势方面，多肽结合特异性高、脱靶毒性低、可通过化学合成大规模制备，介于小分子与抗体之间兼具二者部分优点；局限方面，多肽半衰期短、口服利用度低、易被体内蛋白酶降解。课堂用一张“小分子 vs 多肽 vs 抗体”的对比表，从分子量、靶点类型、给药方式、成本等维度帮学员精准定位多肽药物的适用场景。

2.2 明星案例 GLP-1：以近年爆火的司美格鲁肽（semaglutide）为例，完整拆解一个多肽药物是如何被“工程化”的——通过关键位点的氨基酸替换抵抗 DPP-4 降解、再接上一条脂肪酸链借助白蛋白结合延长循环时间，最终把天然 GLP-1 只有几分钟的半衰期延长到约一周、实现每周一次给药。以此串起“活性—稳定性—给药方式”三者之间的设计取舍。

2.3 其他经典案例：再补充胰岛素（最早的多肽药物之一）、环孢素（天然环肽、少见地可口服、免疫抑制）、多黏菌素（一类抗菌肽/脂肽）等案例，说明不同结构类型（线性、环状、脂化）对应着不同的成药策略与适应症，帮助学员建立“结构—性质—用途”的对应感。

3. 多肽设计要解决的核心难题（逐条讲）

3.1 活性与特异性：设计的第一目标是让多肽能有效地结合并调控目标靶点，同时尽量避免结合到其他蛋白造成脱靶副作用。会讲清活性（结合得牢不牢、功能强不强）与特异性（认得准不准）常常需要权衡，是贯穿全课程的核心矛盾。

3.2 稳定性与半衰期：体内存在大量蛋白酶，会在特定位点（如胰蛋白酶偏好切在 Lys/Arg 之后）把多肽切碎；同时肾脏会快速清除小分子量的肽。讲清这两条降解/清除途径，为第六主题的环化、订书、D-氨基酸等稳定化改造手段做铺垫。

3.3 膜穿透与口服利用度：多肽通常带电、亲水、分子量偏大，很难穿过细胞膜或肠道上皮，这也是绝大多数多肽药物只能注射给药、靶点主要局限在细胞外的根本原因。理解这一点，才能明白为什么“细胞穿膜肽（CPP）”是一个独立且重要的研究方向。

3.4 免疫原性、毒性/溶血性：外源多肽可能引发免疫反应，某些高疏水/高正电的序列会破坏人体自身细胞膜造成溶血或细胞毒。强调在设计阶段就必须把“安全性”当作硬约束，与活性一起优化，而不是等到最后才补救。

4. 机器学习与大模型入门（面向零基础）

4.1 用手写数字识别建立直觉：借助最经典的手写数字识别例子，把机器学习拆解为“输入 → 模型 → 输出”三段——输入是一张图（或一条序列），模型是一堆可调参数，输出是一个类别或分数。由此自然引出训练集（用来学）、验证集（用来调）、测试集（用来公正评估）三者的分工。

4.2 特征与标签：讲清有监督学习的两个核心概念——把一条多肽用某种方式变成一串数字，就是“特征”；它对应的活性、毒性或是否为抗菌肽，就是“标签”。模型要做的，就是学习从特征到标签的映射关系。用多肽的真实例子替换抽象说法，降低理解门槛。

4.3 判别 vs 生成：用一句话讲清两类模型的分工——判别模型回答“这条肽好不好/是不是抗菌肽”（做打分、分类、预测），生成模型回答“帮我造一条符合要求的新肽”（做设计、生成）。整门课程正是围绕“判别 + 生成”这两条主线交替展开的。

4.4 过拟合与泛化：用“死记硬背题库 vs 真正学会解题”的比喻讲清过拟合，说明为什么必须留出测试集、为什么模型在训练集上的高分不能代表真实能力。特别强调在生物序列里一个常见陷阱：如果训练集和测试集含有高度相似的序列，会造成“数据泄漏”、严重高估性能，因此需要按序列相似度而非随机来划分数据。

4.5 从判别到大模型：解释什么叫“从头设计”（de novo design）——不再依赖已知的天然模板去改造，而是让模型直接生成全新的序列甚至结构。再说明为什么近年的大模型（蛋白质语言模型、扩散模型）让这件原本极难的事情第一次变得真正可行，为后续各主题定下总基调。

5. 动手：代码环境搭建 *

5.1 命令行/Linux 基础：带零基础学员认识终端，理解“用文字命令操作电脑”这件事，并掌握做科研计算最常用的一小撮命令与虚拟环境管理。

▸ 演示 cd（进目录）、ls（看文件）、mkdir（建目录）、cp/mv（复制移动）等基本命令，并创建一个课程项目文件夹 peptide-course/

▸ 用 conda create -n peptide-ai python=3.10 创建虚拟环境，再 conda activate peptide-ai 激活它，讲清“为每个项目单独建环境”的好处

5.2 VS Code + Jupyter：搭建一个既能写脚本、又能交互式探索数据的编程环境，这是后面所有实操的“主战场”。

▸ 在 VS Code 中打开项目文件夹、安装 Python/Jupyter 扩展、选择刚建好的 conda 内核

▸ 新建一个 .ipynb，在第一个 cell 里 print 一条多肽序列并运行，确认环境跑通

5.3 Python 极简入门：只挑做数据分析必需的最小知识集——变量、列表、字典、for 循环、条件判断、函数——用多肽相关的小例子把它们串起来，避免大而全的语法轰炸。

▸ 小练习：写一个函数 count_aa(seq)，输入一条序列、返回每种氨基酸出现的次数（用字典实现）

5.4 安装依赖：讲清“库”是什么、为什么要装，用 pip/conda 安装本课程会反复用到的 numpy、pandas、matplotlib、biopython，并介绍 requirements.txt 如何让环境可复现。

5.5 拓展：vibe coding（AI 辅助写代码）：现场演示如何用 AI 编程助手把一句自然语言需求（例如“读入这个 FASTA 并画出长度分布”）直接变成可运行代码，让零基础学员也能快速产出结果、把精力集中在生物问题本身而非语法细节上。

6. 动手：常用数据库与可视化 *

6.1 多肽数据库导览：介绍多肽研究中最常用的几个专业数据库，讲清各自收录什么数据、字段含义以及如何检索下载，让学员知道“做设计前去哪里找数据”。

▸ 在 APD3 / DBAASP 中按活性、来源检索抗菌肽，在 CPPsite 中检索细胞穿膜肽，在 PepBDB 中查肽-蛋白复合物结构

▸ 把感兴趣的一批序列导出为 FASTA 文件，供后续分析使用

6.2 PyMOL / Mol* 可视化：教学员把抽象的序列/坐标“看见”，建立结构直觉，这是理解结合、穿膜等机制的前提。

▸ 加载一条多肽的 PDB 文件，在 cartoon（卡通）与 stick（棒状）显示之间切换

▸ 旋转视角、测量残基间距离、给关键残基上色，并导出一张出版级结构图

6.3 biopython / biotite：用几行 Python 代码完成常见的序列/结构处理——读取 FASTA、计算序列长度、分子量与理论等电点（pI），以及解析 PDB/mmCIF 提取原子坐标，为实战项目的批量分析打基础。

7. 实战项目

7.1 数据获取：从 DBAASP 下载一批抗菌肽序列，用 pandas 把它们整理成一张规范的 CSV 表（包含序列、长度、活性标注等字段），并做基本的清洗（去重、去掉含非法字符的序列）。

7.2 性质画像：用 biopython 批量计算每条肽的净电荷、GRAVY 疏水性指数、螺旋倾向等描述符，再用 matplotlib 画出各性质的分布直方图与两两散点图，形成本课程的第一份“数据画像”报告，让学员亲手体会“数据长什么样”。

二、多肽的结构预测与表征

1. 先搞懂“结构”是什么

1.1 四级结构层次：系统讲解蛋白质/多肽结构的四个层次——一级结构（氨基酸序列本身）、二级结构（α 螺旋、β 折叠等局部规则构象）、三级结构（整条链在空间中的折叠方式）、四级结构（多条链的组装）。用配图把四个层次一一对应，让学员建立“序列决定结构、结构决定功能”的整体框架。

1.2 二级结构识别：详细讲α 螺旋与β 折叠各自的氢键规律和几何特征（螺距、方向），并训练学员在 PyMOL 里一眼认出它们。对多肽尤其重要的是两亲性 α 螺旋——这是抗菌肽、细胞穿膜肽发挥功能的常见结构基础。

1.3 短肽为什么“不好定”：深入解释短肽结构预测的难点——残基数量少、缺乏能够稳定折叠的疏水核心，导致其构象在溶液中高度动态、在多个状态之间快速切换，因此单一的静态预测结构往往不能真实代表它的行为。这一节帮学员对预测结果保持恰当的怀疑态度。

1.4 环化/订书如何锁构象：讲清环化、订书、二硫键等共价约束是如何大幅压缩多肽可及的构象空间、把它“锁定”在有活性的构象上的，从结构角度解释为什么这些改造既能提升稳定性、又常常能提升活性。

2. 为什么要预测结构

2.1 结构决定功能：用具体例子说明——结合口袋在形状和电荷上的互补决定了能否结合、两亲性螺旋的疏水面决定了能否插入细胞膜——让学员理解“想设计功能，必须先掌握结构”。

2.2 结构是设计的前提：指出后续几乎所有高级方法（分子对接、binder 从头设计、结合界面分析、结构层面的稳定化改造）都以三维结构为输入，因此结构预测是整个 AI 多肽设计流程的基础环节。

3. 传统预测方法（简要了解）

3.1 同源建模：介绍用 SWISS-MODEL / MODELLER 依据同源模板搭建结构的经典思路，并指出多肽往往缺乏合适同源模板、传统同源建模在多肽上常常失效的局限，从而引出深度学习方法的必要性。

3.2 分子动力学：讲解用力场在计算机中模拟肽在水环境里随时间运动、采样多种构象的思路，并借此建立“构象系综”（一个肽对应一群构象而非单一结构）的重要概念。

3.3 分子对接原理：说明分子对接是把配体或多肽放进受体口袋、用打分函数（近似结合能）来评估并排序不同结合姿势（pose）的过程，是研究“肽如何结合靶点”的基础工具。

3.4 动手：用 AutoDock Vina 做一次肽-受体对接 *

▸ 用 PyMOL/OpenBabel 准备受体：去除水分子、加氢、转换为 pdbqt 格式

▸ 在结合口袋周围定义对接盒子（center_x/y/z 与 size_x/y/z）

▸ 编写 config 并运行 vina，得到多个 pose 及其结合能（affinity, kcal/mol）

▸ 在 PyMOL 中载入最优 pose，观察氢键、盐桥等关键相互作用

4. AlphaFold 的直觉理解（不讲公式）

4.1 共进化信号：用通俗语言解释共进化——在漫长演化中，如果两个残基在空间上相互接触，它们往往会“成对地一起突变”以维持相互作用；因此从多序列比对（MSA）里统计出的这种共变信号，就成了推断三维接触、进而推断结构的核心线索。

4.2 注意力机制大白话：不写任何公式，用“阅读时该重点看哪些字”的比喻讲清注意力机制——模型会为每个残基学习它应该重点关注序列中的哪些其他残基，从而高效地捕捉远距离的相互作用。

4.3 AF2 两大部件：拆解 AlphaFold2 的核心流水线——EvoFormer 模块反复地在“MSA 表示”和“残基对表示”之间交换信息、提炼共进化与几何线索；结构模块再把这些抽象表示翻译成具体的三维坐标；最后通过 recycling（把输出再喂回输入）多轮迭代逐步精修。

4.4 AF3 与扩散：介绍 AlphaFold3 用扩散式生成的方式直接“画”出原子坐标，并把预测范围从单纯的蛋白扩展到蛋白-核酸-配体-离子的通用复合物，说明这对研究多肽与小分子、核酸共同作用的体系意义重大。

4.5 ESMFold：讲清 ESMFold 用蛋白质语言模型学到的表示直接替代了耗时的 MSA 搜索，因此可以在单条序列上秒级出结构，特别适合缺乏同源信息的人工设计短肽的快速筛查。

4.6 专题 AlphaFold3：作为专题深入讲 AF3 的关键变化（用 Pairformer 替代 EvoFormer、用扩散头生成坐标），演示它在预测肽-蛋白/肽-配体复合物上的能力，同时客观讨论它在高柔性多肽和弱结合体系上的局限与使用注意事项。

5. 动手：预测一条多肽的结构 *

5.1 ColabFold / AlphaFold2 预测单肽：使用 ColabFold（AlphaFold2 的轻量在线实现）完整跑一遍单肽预测，理解每一步在做什么。

▸ 在 ColabFold notebook 中粘贴目标序列，选择 MSA 模式（对短肽可对比 single-sequence 与建 MSA 的差异）

▸ 运行预测，下载 5 个模型的 PDB 及 pLDDT/PAE 结果文件

▸ 在 PyMOL 中按 b-factor(pLDDT) 着色查看结构，识别高/低置信区域

5.2 ESMFold 快速预测：用 ESMFold 的网页版或本地 API 对同一条序列一键出结构，直观感受它相比 AF2 在速度上的巨大优势以及在精度上的取舍。

5.3 对比分析：针对同一条柔性短肽，把 AF2 与 ESMFold 的预测结果叠合比较（计算 RMSD、对比 pLDDT），引导学员讨论“什么时候该信 AF2、什么时候用 ESMFold 就够了”，培养对预测结果的批判性判断。

6. 动手：预测复合物与环肽 *

6.1 肽-蛋白复合物：用 AlphaFold-Multimer 或 AF3 预测多肽与靶蛋白结合后的复合物结构，重点看界面区域的 pLDDT 与链间 PAE，用它们判断预测的结合模式是否可信——这是后续 binder 设计中反复要用到的技能。

6.2 环肽/大环肽：介绍并使用 HighFold 等专门处理环化约束的工具来预测环肽/大环肽结构，同时演示普通 AF2 在处理头尾环化、二硫键约束时的失真，让学员明白“选对工具”的重要性。

7. 动手：看懂预测结果好不好 *

7.1 pLDDT：讲清 pLDDT 是模型对每个残基局部结构的置信度打分（0–100），一般 >70 相对可信、>90 很可信，而柔性区/无序区往往偏低；教学员不要盲信一个漂亮的结构，而要先看置信度分布。

7.2 PAE：讲解预测对齐误差（PAE）热图如何反映“两个残基相对位置”的可信度，并演示如何用它判断不同结构域之间、以及肽-靶界面之间的相对摆放是否可靠。

7.3 fpocket：用 fpocket 在靶点结构上自动检测口袋并给出可药性（druggability）评分，帮助学员在设计前先定位“应该把结合肽做到哪里去”。

8. 实战项目

8.1 批量结构预测：对第一主题产出的一组候选肽用脚本批量调用 ESMFold 预测结构，按 pLDDT 自动筛选出高置信构象，体验“把单次操作工程化为批处理流程”的思路。

8.2 复合物分析：挑选一个感兴趣的靶点，预测一个肽-靶点复合物，用 PyMOL 标注界面残基、氢键与盐桥，产出一张带注释的结合模式图，并写一小段结合机制说明。

三、抗菌肽（AMP）设计

1. 认识抗菌肽

1.1 来源与定义：介绍抗菌肽是广泛存在于动物、植物、微生物体内的天然免疫效应分子，是宿主抵御病原的第一道防线；从序列上看，它们通常较短（约 10–50 个残基）、带正电、并具有两亲性，这些共性正是后续做预测和设计时最重要的特征。

1.2 分类：按二级结构把抗菌肽分为α 螺旋型（如 magainin、LL-37）、β 折叠型（常含二硫键，如 defensin）、环状型与延伸型（富含特定氨基酸如脯氨酸、色氨酸）四大类，并说明不同类型在稳定性、活性谱与设计难度上的差异。

1.3 为什么重要：结合当前全球抗生素耐药（AMR）的严峻形势，说明抗菌肽因主要作用于细菌膜的物理性质、细菌难以通过单点突变快速逃逸，被寄望为对抗“超级细菌”的新型武器，凸显这一研究方向的现实意义。

2. 抗菌肽是怎么杀菌的

2.1 膜破坏模型：详细讲解经典的桶板（barrel-stave）、地毯（carpet）、环孔（toroidal-pore）三种膜破坏模型——带正电的抗菌肽先通过静电吸附到带负电的细菌膜表面，再借助疏水面插入脂双层、最终破坏膜的完整性导致细菌死亡。理解机制有助于理解为什么电荷和两亲性如此关键。

2.2 胞内靶点：说明并非所有抗菌肽都靠破膜，一部分能穿过膜进入胞内，抑制 DNA/RNA 或蛋白质合成、干扰细胞分裂等，作用机制更接近传统抗生素。

2.3 为什么不容易耐药：解释由于抗菌肽针对的是细菌膜较为保守的整体物理化学性质，而非某个具体的蛋白靶点，细菌很难通过少数几个突变就获得抗性，这是抗菌肽相对传统抗生素的核心优势。

3. 哪些性质决定活性（关键参数 + 如何量化）

3.1 净电荷：抗菌肽的净电荷通常在 +2 到 +9 之间，正电有利于吸附到带负电的细菌膜。课堂讲解如何根据序列中带电残基数目和给定 pH 值计算净电荷，并讨论电荷过高可能带来的毒性问题。

3.2 疏水性：疏水性决定了肽插入膜的能力，可用 GRAVY 值或“疏水矩”来量化。强调这是一把双刃剑——适度疏水利于杀菌，过度疏水则容易破坏人体自身细胞膜、导致溶血。

3.3 两亲性：讲解两亲性指分子同时具备明显的亲水面和疏水面，对α 螺旋型抗菌肽可用“螺旋轮投影”直观展示极性/疏水残基是否分列两侧，并用疏水矩定量。两亲性是膜活性的关键结构基础。

3.4 螺旋度与长度：讨论螺旋倾向、序列长度对活性和选择性的综合影响——太短往往不足以形成稳定膜活性构象、太长则合成成本高且毒性风险上升，设计时需要在多个参数间寻找平衡。

4. 传统怎么设计和筛选

4.1 理化性质/模板改造：介绍最经典的做法——在一条已知的天然抗菌肽模板上做定点突变，系统调节净电荷、疏水性、两亲性，观察活性变化，逐步优化。这是理解后续 AI 方法的对照基线。

4.2 QSAR：讲解定量构效关系（QSAR）如何在“理化描述符”与“抗菌活性”之间建立回归关系，从而在实验之前就预测并指导优化方向，是机器学习进入这个领域之前的主流量化手段。

4.3 经典机器学习：介绍用支持向量机（SVM）、随机森林等传统模型配合人工设计特征来判别一条序列是否为抗菌肽的经典工作思路（如 CAMP、AMPScanner 等），为后面对比深度学习方法做铺垫。

5. 用模型来“打分”（判别模型）*

5.1 序列编码：系统讲解把一条氨基酸序列转化为模型可读数字的几种主流方式——one-hot 编码、理化性质向量、k-mer 频率，以及用预训练蛋白语言模型（如 ESM）直接提取的高维 embedding，并比较它们在信息量、数据需求和效果上的优劣。

5.2 抗菌活性预测：既介绍如何直接调用现成工具，也带学员从零训练一个属于自己的抗菌活性分类器，完整体验判别模型的构建流程。

▸ 准备正样本（已知 AMP）与负样本（非 AMP 序列），注意平衡与去冗余

▸ 为每条序列提取手工特征或 ESM embedding，构建特征矩阵

▸ 训练分类器（随机森林或小型 MLP），用交叉验证 + ROC-AUC/PR-AUC 评估

▸ 绘制 ROC 曲线、分析哪些特征最重要

5.3 毒性/溶血性预测：介绍并使用 HemoPI、ToxinPred 等工具对候选肽做溶血性、毒性预测，把“安全性”作为与活性并列的筛选维度，避免设计出高活性但高毒的序列。

5.4 手工特征 vs 端到端：通过在同一数据集上对比“传统理化特征 + 随机森林”与“蛋白语言模型微调”两条技术路线的表现，让学员直观理解深度学习/大模型带来的增益，以及它对数据量的要求。

6. 用模型来“造肽”（生成模型）

6.1 VAE：用“压缩再还原”的比喻讲清变分自编码器——把序列编码进一个连续的隐空间，再从隐空间解码回序列；训练好后可以在隐空间中采样或插值，从而生成全新的候选肽（以 HydrAMP 等抗菌肽生成工作为例）。

6.2 GAN：讲解生成对抗网络的核心思想——生成器不断尝试造出以假乱真的肽，判别器不断学习分辨真假，两者对抗训练直到生成器能产出逼真的序列（以 PepGAN 等思路为例），并讨论 GAN 在离散序列上训练不稳定的难点。

6.3 扩散模型：用“从一团噪声里逐步显影出图像”的直觉讲清扩散模型，说明它如何通过反复去噪来生成序列或结构（以 AMP-Diffusion 等思路为例），并点明它正是当前 RFdiffusion、AlphaFold3 等前沿方法的共同基石。

6.4 语言模型/大模型：讲解如何用 GPT 式自回归模型按条件“写”出抗菌肽，或用 BERT 式模型（如 ESM）通过掩码采样来生成/改造序列，把第五主题的大模型能力直接对接到抗菌肽设计上。

6.5 专题：深度学习引导的 AMP 发现闭环：以一篇代表性研究为主线，完整拆解现代抗菌肽发现的工业级闭环流程——用生成模型产出海量候选、经活性/毒性/新颖性多级计算过滤大幅缩小范围、挑选少量候选进行化学合成、再回到湿实验测定最小抑菌浓度（MIC）验证、并把实验结果回填数据反哺模型，形成“干湿结合”的迭代设计范式。

7. 实战项目

7.1 判别筛选：用第 5 节训练好的判别模型对一批候选肽进行抗菌活性打分和排序，结合毒性预测卡定阈值，输出一份“值得进一步关注”的候选短名单。

7.2 生成 + 过滤：用生成模型批量产出上千条候选序列，再串联抗菌活性、溶血性、与天然序列相似性等多个过滤器逐层筛选，最终留下多样且有潜力的 Top-N，完整体验“大量生成 + 严格过滤”的设计哲学。

7.3 文章复现：选取一篇有代表性的抗菌肽生成设计论文，复现其核心的设计-筛选流程，产出候选清单并逐条给出入选理由，训练学员阅读并落地前沿文献的能力。

四、靶点结合肽 / Binder 从头设计

1. 什么是结合肽 / binder

1.1 结合位置：讲清结合肽要真正发挥作用，必须精准占据靶点的功能位点或蛋白-蛋白相互作用界面，从而阻断或激活其功能；设计的第一件事就是想清楚“要结合到靶点的哪个部位”。

1.2 表位与热点：区分两个关键概念——表位（epitope）是靶点上被结合肽覆盖的整片区域，而热点（hotspot）是这片区域中贡献了绝大部分结合能的少数关键残基。讲解如何通过实验的丙氨酸扫描或计算方法找出 hotspot，并以此作为设计的“锚点”。

1.3 结合肽 vs 蛋白 binder：对比多肽结合物与更大的蛋白结合物——多肽更小、更灵活、更易化学合成和修饰，但可埋藏的结合面积小、天然亲和力往往偏弱，因此常需要环化、订书、引入非天然氨基酸等手段来弥补，这也串联起第六主题的优化方法。

2. 设计的整体流程（先看全貌）

2.1 三步法：先给学员一张全景图——现代从头 binder 设计通常分三步：先生成合理的三维骨架（决定“长什么形状”）、再为骨架设计氨基酸序列（决定“用哪些残基”）、最后回测验证并迭代优化（判断“靠不靠谱、要不要重做”）。理解这个总框架后再逐步深入每一步，学员不会迷失在工具细节里。

3. 第一步：生成骨架

3.1 RFdiffusion 直觉：用“从一团随机噪声出发、一步步去噪、逐渐长出合理蛋白主链”的直觉讲清 RFdiffusion；说明它既可以无条件生成全新结构，也可以在给定条件下定向生成，是目前从头结构设计最主流的扩散模型。

3.2 施加约束：讲解如何把设计意图“告诉”模型——指定要结合的靶点、锚定到指定的 hotspot、或围绕一段固定的功能 motif 生成支架（motif scaffolding），从而让生成的骨架天生就“面向靶点”。

▸ 准备靶点结构并确定 hotspot 残基编号

▸ 用 contigs 语法描述“靶点固定 + 结合肽长度范围”，设置 hotspot 参数

▸ 运行 RFdiffusion 生成多条候选骨架，并初步筛掉明显不合理的构象

3.3 专题 RFpeptides：作为专题介绍 RFpeptides 如何在 RFdiffusion 流程中引入环化处理，实现大环肽 binder 的从头设计，并结合已发表的实验验证成功案例，讲清这条路线的实际威力与适用范围 *

4. 第二步：设计序列 *

4.1 ProteinMPNN：讲解 ProteinMPNN 的作用——给定一条主链的三维坐标，预测每个位置放哪种氨基酸能最稳定地折叠成这个形状；并说明采样温度（temperature）如何在“保守可靠”和“多样探索”之间调节。

▸ 输入上一步生成的骨架 PDB

▸ 设置采样温度、指定需要固定或允许变化的位置（如保留界面关键残基）

▸ 批量生成多条候选序列，供下一步回测

4.2 多肽注意点：针对多肽的特殊性提醒若干实操细节——短肽两端的处理、环化位点残基的选择、以及尽量避免使用化学合成困难或易氧化的残基，让设计结果更容易真正被合成出来。

5. 第三步：验证与打分 *

5.1 AF2 回测：讲解 binder 设计中最重要的“自洽性”检验——把 ProteinMPNN 设计出的序列单独喂给 AlphaFold2 重新折叠，看它能否折回当初设计的目标构象；用 pLDDT 和与目标结构的 RMSD 来量化，是过滤失败设计最有效的手段之一。

5.2 界面评估：介绍一系列评估结合可信度的指标——界面 PAE（interaction PAE）、界面 pLDDT、界面接触残基数、以及近似结合能等，教学员综合这些指标判断哪些候选真正有希望结合。

5.3 迭代优化：强调从头设计是一个循环而非一次成功——对未通过回测的候选，回到骨架生成或序列设计步骤调整参数、重新生成，形成“生成—筛选—再生成”的迭代闭环，这也是真实设计工作的常态。

6. 实战项目

6.1 完整流程：选定一个真实靶点，完整走通 RFdiffusion 生成骨架 → ProteinMPNN 设计序列 → AlphaFold2 回测与排序 的从头结合肽设计流水线，把本主题所有工具串成一条可复用的 pipeline。

6.2 输出：整理排名靠前的候选肽，产出结构图、界面指标汇总表与设计说明文档，形成一份可以拿去和实验合作者讨论的完整设计报告。

五、面向功能的多肽序列生成与大模型

1. 语言模型是什么（从头讲起）

1.1 序列即“句子”：用一个贯穿全章的核心类比——把 20 种氨基酸当作“字”、把一条蛋白/多肽序列当作一句“话”，那么让模型学习蛋白序列，本质上就和让它学习一门语言一样。这个类比帮零基础学员一下子抓住蛋白语言模型的直觉。

1.2 RNN 直觉：讲解早期的循环神经网络如何像人一样一个字一个字地顺序阅读、并用一个不断更新的“隐藏状态”记住前文，同时指出它在处理很长序列时容易“忘记”开头、难以捕捉长程依赖的固有缺陷。

1.3 Transformer 直觉：讲清 Transformer 用自注意力机制让序列中任意两个位置都能直接“对话”，因此既能高效并行计算、又特别擅长捕捉相距很远的残基之间的关联——这正是它取代 RNN、成为所有现代大模型基石的原因。

1.4 预训练在学什么：解释在海量无标注的天然蛋白序列上做“完形填空/接龙”式的自监督预训练，模型能够自发地学到氨基酸之间的搭配规律、进化保守性乃至结构倾向，从而得到一套可迁移到各种下游任务的通用表示。

2. 两种典型：BERT 与 GPT

2.1 BERT / 掩码式：讲解 BERT 式模型通过“完形填空”（随机遮住一些残基、让模型预测被遮住的是什么）来训练，因而特别擅长理解序列、给序列或突变打分，蛋白领域的 ESM 系列正属于这一类。

2.2 GPT / 自回归：讲解 GPT 式模型通过“文字接龙”（根据前面的残基预测下一个残基）来训练，因而天然擅长逐位地生成全新序列，是条件化蛋白/多肽生成的主力架构。

2.3 对应到多肽：把两类模型的分工落到多肽任务上——掩码式模型主要用于突变效应打分、天然性评估与特征提取，自回归/生成式模型主要用于按功能需求从头生成候选序列。

3. ESM 系列深入

3.1 ESM 系列模型演进：回顾 ESM-1b（650M 参数）→ ESM-2（8M 到 15B 多规格）→ ESMFold（结构预测）→ ESM-IF（反向折叠）的发展脉络；说明 ESM-2 是当前蛋白质序列表示的 state-of-the-art 模型，也是本课程做表征、打分与微调的默认主力模型。

3.2 ESM2-650M 架构解析：讲解 33 层 Transformer、1280 维 embedding、约 6.5 亿参数的规模；说明 ESM-2 在 UniRef50 上进行自监督预训练，通过掩码语言建模从数以亿计的天然序列中学到了蛋白质家族的进化约束与结构倾向，这也是它的 embedding 能广泛迁移的根本原因。

3.3 ESM2 在多肽评估中的应用（Perplexity 打分）：讲解 perplexity（困惑度）的直观含义——模型认为该序列“像不像”天然蛋白质；perplexity 越低，说明序列越符合天然蛋白质的统计规律，因而可以直接作为多肽“天然性 / 可折叠性”的一个廉价初筛指标，在做完生成后用它快速剔除明显不合理的序列。

▸ 用 transformers/fair-esm 加载 esm2_t33_650M_UR50D 模型与对应 tokenizer

▸ 对每条候选多肽逐位做掩码、累加对数似然，计算 (pseudo-)perplexity

▸ 按 perplexity 从低到高排序，剔除高困惑度（明显不像天然蛋白）的候选

3.4 从 ESM2 到 PepMLM（微调策略与条件化生成）：解释 PepMLM 如何在 ESM2-650M 的基础上，使用 PepNN 和 Propedia 数据库中的肽-蛋白配对数据进行微调；其核心变化在于把靶蛋白序列作为条件（condition）拼接进输入，强制模型学习“给定靶点、生成能与之结合的肽”的映射关系，从而把一个通用的蛋白语言模型改造成一个面向靶点的结合肽生成器。这一节把“预训练大模型 + 任务微调 + 条件化生成”的完整范式讲透。

4. 怎么让模型“按需求”生成

4.1 预训练 + 微调范式：讲清当今大模型应用的主流范式——先用海量通用数据预训练出一个“懂蛋白语言”的基座模型，再用相对少量的任务数据进行微调，让它专精于某个具体功能，这样既省数据又省算力。

4.2 条件生成：讲解条件生成的思想——把想要的功能标签、类别或靶点序列作为额外输入“条件”喂给模型，引导它只生成满足该条件的序列，而不是漫无目的地乱生成，这是可控设计的关键。

4.3 专题 ProGen / ZymCTRL：以 ProGen、ZymCTRL 为例讲解如何用控制标签（如蛋白家族、酶功能）来条件化地生成蛋白序列，并讨论如何把这套成熟思路迁移到多肽的功能条件生成上。

4.4 扩散生成功能肽：介绍在序列空间或结构空间上运用扩散模型、并结合条件约束来生成目标功能多肽的新兴思路，把第四主题的扩散结构生成与本章的功能序列生成联系起来。

5. 生成特定功能的肽

5.1 细胞穿膜肽（CPP）：讲解 CPP 的典型序列特征（富含精氨酸/赖氨酸、常具两亲性），以及为什么它是解决多肽“进不了细胞”这一核心难题的关键工具；并说明如何用条件生成模型定向产出 CPP 候选。

5.2 抗癌肽：介绍抗癌肽（尤其是膜裂解型）如何利用肿瘤细胞膜与正常细胞膜在电荷等方面的差异实现选择性杀伤，以及在设计时如何兼顾疗效与对正常细胞的安全性。

5.3 信号肽等：简要介绍信号肽、抗病毒肽、激素肽等其他功能肽的生成任务，说明本章方法框架具有很强的通用性，可迁移到各类功能目标。

5.4 动手：微调一个小模型生成目标肽 *

▸ 准备目标功能数据集（如 CPP 的正负样本），做清洗与划分

▸ 在 ESM2 或一个小型自回归模型上进行微调（可用 LoRA 等轻量方式降低算力需求）

▸ 从微调后的模型采样生成候选序列，去重并做初步长度/组成过滤

6. 生成完怎么评估好坏 *

6.1 天然相似性：用 BLAST 比对或 embedding 空间距离衡量生成序列与已知天然序列的接近程度；强调要在“足够像天然（可能可折叠、可表达）”和“足够新颖（有专利与创新价值）”之间取得平衡。

6.2 多样性：用序列聚类或计算候选之间的两两相似度来评估生成结果是否过于雷同——一个只会反复生成几乎相同序列的模型是没有实用价值的，多样性是衡量生成质量的重要维度。

6.3 结构合理性：用 ESMFold 或 AF2 对生成序列快速回测，看其能否折叠成 pLDDT 较高的合理结构，把结构不合理的候选提前淘汰。

6.4 成药性初筛：把第六主题的毒性、溶血性、稳定性等预测器作为前置过滤器接入生成流程，尽早剔除高风险候选，避免把宝贵的实验资源浪费在注定失败的序列上。

7. 实战项目

7.1 目标：以“设计一批细胞穿膜肽（CPP）”为具体目标，把本章学到的微调与条件生成方法真正用起来。

7.2 流程：完整走一遍数据准备→ 模型微调 → 批量生成 →（perplexity / 结构合理性 / 毒性）多指标联合筛选 → 输出 Top-N 候选并逐条说明入选理由 的闭环，产出一份可交付的生成设计报告。

六、多肽性质预测、优化与工程改造（成药性）

1. 成药性到底看哪些指标

1.1 稳定性：讲解体内蛋白酶如何在特定位点降解多肽（例如胰蛋白酶偏好切在 Lys/Arg 之后），如何从序列上识别这些潜在的“易切位点”，并如何评估一条肽在血浆中的整体稳定性，这是多肽能否成药的第一道门槛。

1.2 半衰期：说明多肽的体内半衰期主要由肾小球滤过（与分子量相关）和酶解共同决定，并预告后面会讲到的延长策略——PEG 化、脂肪酸修饰、与白蛋白结合等，把“为什么半衰期短”和“怎么解决”连起来讲。

1.3 膜穿透性：分析影响多肽穿膜能力的主要因素（脂水分配系数 logP、净电荷、两亲性、分子量等），并介绍可用于预测穿膜概率的计算工具，呼应第一主题提出的“多肽进不了细胞”这一核心难题。

1.4 毒性与免疫原性：讲解需要评估的几类安全性风险——对红细胞的溶血性、对正常细胞的细胞毒性、以及可能引发免疫反应的 T 细胞表位，强调这些指标必须与活性同步优化。

2. 动手：用模型预测这些性质 *

2.1 稳定性/半衰期：用基于序列规则的方法标注出潜在的蛋白酶切割位点，并结合预测工具给每条候选肽打一个稳定性评分，产出一张“稳定性风险清单”。

2.2 膜穿透/CPP：使用 CellPPD 等在线/本地工具批量预测候选肽的细胞穿膜概率，筛选出更可能进入细胞、适合作用于胞内靶点的序列。

2.3 毒性/免疫原性：使用 ToxinPred 预测毒性、用免疫原性/表位预测工具评估免疫风险，把高风险候选在计算阶段就过滤掉，降低后续实验成本。

3. 从结构上让肽更“耐用”

3.1 环化：讲解头尾酰胺环化与二硫键环化两类主要环化方式，说明环化如何通过消除易被外切酶识别的自由末端、并限制构象自由度，来同时提升多肽的酶稳定性与结合活性。

3.2 订书肽：讲解订书肽如何通过在螺旋的两圈之间引入一条全碳或硫醚化学桥，把α 螺旋“钉”得更稳固，从而显著提升其蛋白酶抗性、结合亲和力乃至细胞穿透能力，是近年热门的多肽稳定化策略。

3.3 非天然氨基酸：介绍引入天然界不存在的氨基酸（如β-氨基酸、N-甲基化氨基酸等）如何让多肽逃避蛋白酶识别、并精细地调节其溶解度、刚性与穿膜性等理化性质。

3.4 D-氨基酸/逆序-D：讲解用 D 型氨基酸替换 L 型、乃至采用“逆序-D”（retro-inverso）策略，如何在尽量保持结合构象的同时，让多肽几乎完全逃脱只识别 L 型底物的蛋白酶降解，是提升稳定性的强力手段。

4. 用机器学习帮忙改造（优化）*

4.1 零样本突变效应预测：讲解如何用 ESM-1v / ESM-2 这类蛋白语言模型，在完全不需要额外训练数据的情况下（zero-shot），直接根据模型对突变前后序列的打分变化来预测某个突变是有益还是有害，从而快速圈定值得尝试的突变。

▸ 对目标肽的每个位置，枚举其所有可能的单点突变

▸ 用语言模型计算每个突变体相对野生型的对数似然差（打分）

▸ 按打分排序、挑出高分突变，并尝试将多个有益突变组合叠加

4.2 定向进化思路：讲解经典定向进化“构建突变库 → 高通量筛选 → 富集迭代”的实验范式，并说明机器学习如何通过预测有希望的突变、大幅减少需要实验筛选的轮次和规模，实现“更聪明地进化”。

4.3 Low-N 策略：讲解在实验数据极其有限（仅几十条）的现实场景下，如何借助预训练模型强大的先验表示，只用少量标注数据就训练出可用的性质预测或优化模型，解决生物领域普遍存在的“小数据”难题。

4.4 用自有数据训练小模型：手把手带学员把自己实验室积累的活性/稳定性等实测数据整理成规范训练集，在 ESM 等预训练表示之上微调一个轻量的回归/分类头，得到一个贴合自身课题的定制化预测模型。

5. 实战项目

5.1 全流程串讲：给定一条初始多肽，完整演示“性质预测 → 定位薄弱环节（如某处易被降解或毒性偏高）→ 用环化/突变等手段针对性优化 → 重新预测验证”的迭代闭环，把全课程学到的判别、生成、优化能力融会贯通。

5.2 学员小项目：给定一个真实的靶点或功能目标，让学员独立走一遍“设计 → 结构预测 → 性质预测 → 优化”的完整流程，最终产出一批候选多肽以及一份图文并茂的设计报告。

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