NBT：把“基因手术”做到千碱基级，复旦大学汪凌波和张锋开发DoPE，实现无疤痕、文库兼容的精准写入

精确定义DNA序列的插入使得能够对基因组进行靶向操作，用于实验和治疗应用，如模拟致病变异、校正致病等位基因以及将转基因表达盒导入免疫细胞或干细胞系。例如，将嵌合抗原受体（CAR）模块定点插入到安全港基因座，与病毒整合相比，可以产生更均一且可能更安全的T细胞产品。

同源定向修复（HDR）可通过使用供体模板的同源重组介导此类插入，但该过程与非同源末端连接（NHEJ）竞争效率低下。由于HDR需要Cas9诱导的DSBs，它经常产生染色体重排并激活p53依赖的DNA损伤应答，从而限制编辑效率和细胞活力。这些局限性推动了用于精确DNA插入的无DSB方法的发展。

先导编辑（Prime editing）采用Cas9切口酶和逆转录酶的融合蛋白，由结构化的pegRNA引导，可在不引入DSBs的情况下安装确定的序列变化。标准先导编辑可产生长达约50个碱基对（bp）的替换或插入，但对于更大的插入，其效率急剧下降，因为编码插入序列的pegRNA分子变得不稳定。

配对pegRNA方法（如twinPE和GRAND）通过使用配对pegRNA创建互补的3′瓣，部分扩展了插入范围，但仍限于亚千碱基片段。这些较长编辑的低效率反映了延长pegRNA的结构脆弱性和逆转录酶的持续合成能力限制。

尽管使用配对pegRNA引导编辑安装“着陆垫”重组位点的重组酶介导整合可在两步中实现千碱基规模的插入，但由此产生的连接瘢痕可能破坏靶基因座。近期的瓣-退火方法（如PA和PREMIER）使得一步法千碱基规模插入成为可能；然而，文库规模的多种DNA序列插入仍然是一个未解决的挑战。

图1.结合一个互补的供体，一个opegRNA对和一个引物编辑器的DNA插入方法称为DoPE（摘自

Nature Biotechnology

）

作者设想，可能可以通过对配对pegRNA引导编辑进行两项根本性改变来设计一种精确插入方法：第一，为插入片段使用互补的供体分子；第二，产生与pegRNA逆转录酶模板（RTT）区中供体的末端序列互补的基因组瓣。

在作者成功的供体互补引导编辑（DoPE）设计中，作者为插入片段采用了3′突出端双链DNA（odsDNA）供体分子，并使用一对opegRNAs，其包含用于指定靶位点的间隔区序列和用于模板化与供体3′突出端互补的基因组3′瓣所必需的突出端互补RTT（oRTT）。

这些odsDNA分子是在两端均具有单链3′突出端的dsDNA；这两个3′突出端与opegRNA对模板化并由先导编辑器逆转录的双基因组3′瓣完全互补。

在此，作者报道了DoPE方法的开发、初步概念验证测试以及多样化应用部署。值得注意的是，与其使用odsDNA提供插入片段的工作原理一致，作者展示了DoPE允许用户使用单对opegRNAs在单个靶位点进行多种不同的插入，包括原位插入供体文库以进行增强型绿色荧光蛋白（EGFP）变体的遗传筛选。

作者还展示了DoPE在不同靶位点和细胞类型中均能实现插入。作者证明了DoPE可实现从小片段到12.5 kb长度的插入。最后，作者展示了DoPE在校正多种突变方面的成功应用，特别是校正不同的突变等位基因，并通过使用一组odsDNA供体基于序列替换恢复靶基因的蛋白表达。

这些结果展示了DoPE作为PASSIGE、eePASSIGE和PASTE的替代方案，用于需要精确插入DNA片段（包括基因大小片段）的多种应用，但不需要重组酶或转座酶。

参考消息：https://www.nature.com/articles/s41587-026-03296-w