NBT：赵天萌团队改造attB变体实现高效基因整合

发布时间：2026-09-08来源：iNature

位点特异性重组酶，可在不需要外源DNA修复因子的情况下，在一对短的特定序列（attP和attB）之间催化精确的DNA重组。这使得它们在细胞和基因治疗、植物育种中的性状渗入以及合成生物学等应用中具有极高的价值。

2026年9月2日，北京齐禾生科生物科技有限公司赵天萌独立通讯在

Nature Biotechnology

在线发表题为

Engineered genomic attachment sites for site-specific recombinases enable high-efficiency integration in plants and human cells

的研究论文。

该研究开发了一种以DNA为中心的策略，通过合理设计嵌合附着位点来优化位点特异性重组。高活性att变体增强了Bxb1介导的在人类细胞和植物中的整合效率。在这些att变体中，工程化的attB(V111)位点在HEK293T细胞中实现了51.9%的整合效率（是野生型attB的1.7倍），在水稻原生质体中实现了35.6%的整合效率（是野生型attB的4.4倍）。

当与Bxb1催化结构域中的一个工程化单蛋白突变体配对使用时，该优化系统在人类细胞中实现了CD19嵌合抗原受体表达盒31%的靶向整合效率和鸟氨酸氨甲酰转移酶表达盒25%的靶向整合效率。在水稻中，这些工程化变体使得在靶向基因组位点整合一个5.8 kb的除草剂抗性表达盒成为可能，在24%的再生植株中检测到稳定整合。

基于Oxford Nanopore的对编辑植株的长读长测序揭示了完整且精确的插入，具有高特异性。编辑幼苗繁殖至T1植株证实了编辑可遗传至后代。该方法为基于重组酶的基因组编辑提供了一种安全、广泛适用的方法。

位点特异性重组酶，如大丝氨酸整合酶Bxb1，可在不需要外源DNA修复因子的情况下，在一对短的特定序列（attP和attB）之间催化精确的DNA重组。这使得它们在细胞和基因治疗、植物育种中的性状渗入以及合成生物学等应用中具有极高的价值。

一种常见的策略是使用引导编辑在基因组安全港安装一个att位点，然后通过Bxb1介导整合含有另一个att位点的供体表达盒。为了提高该系统的实用性，增强Bxb1的整合活性至关重要。

先前的努力集中于通过定向进化或人工智能辅助预测来工程化重组酶蛋白本身，从而产生了超活性变体如eeBxb1、epBxb1、reBxb1等。然而，赋予蛋白变体高活性的突变常常聚集在DNA结合界面，这增加了非预期脱靶效应的风险，可能带来不可预测的后果。

增强重组酶活性的另一种策略是工程化其att识别位点。然而，为此目的筛选单个突变体是耗时且费力的，尤其是即使较短的attB序列也有38 bp长，使得构建饱和DNA突变文库在理论上是不切实际的。尽管如此，作者认为可以从学习重组酶的结合特性中衍生出更高效的策略。

在自然界中，重组酶常识别一对短DNA序列以形成四聚体并由此催化重组。因此，重组酶至少可识别四种类型的天然序列，每种序列都表现出不同的结合动力学。作者假设可以理性地组合来自已知天然识别位点的最有利序列元件，以绕过广泛的随机筛选工作，从而能够直接工程化高活性嵌合附着位点。这种方法策略性地排除了导致弱结合位点的次优序列，甚至那些没有任何识别活性的序列。

图1.在水稻植物中创建精确大片段插入的一体化策略概述（摘自

Nature Biotechnology

）

在此，作者基于典型att共有序列理性设计了144个attB变体，所有这些变体均被Bxb1重组酶识别，并具有不同的重组活性。从该文库中，作者分离出了超活性attB变体，这些变体能够在人类和植物系统中驱动高效的靶向整合。

在人类细胞中，这些变体使得治疗性货物的稳健整合成为可能，包括靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）和鸟氨酸氨甲酰转移酶（OTC）表达盒。该平台通过全长供体回收、基于下一代测序（NGS）和Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长基因组测序的全基因组特异性分析，以及T1水稻系中编辑的稳定孟德尔遗传进一步得到验证。

参考消息：https://www.nature.com/articles/s41587-026-03294-y

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